关于碱性磷酸酶染色的讨论

treestem

刚开始做碱性磷酸酶染色，有几个让我困惑的问题，希望有经验的家人多多指教!# t8 E2 U; u$ S) P" ^$ A; m
目前用的较多的方法是：NBT，但我感觉NBT染出来是蓝色的，而非紫色和红色。哪位知道什么试剂染出来是红的吗？
: [8 g3 h( Y4 ^$ w另外，为什么有的protocol上说要固定30min，有的说要固定30秒，有的是2min，固定的时间影响很大吗？: x0 x* g2 O1 T- N7 X( g
PBS洗的时间有影响吗？" q! {, y# O3 l" @0 _) c" D
TBST的作用是什么？有的protocol中就没有TBST？) D* B  [, l* e$ Y

tjbone

偶氮偶联法（Kaplow法）% Z, X4 c5 T! S
原理
1 y2 m! G6 y- [8 x. ?. y中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶在pH9.2~9.8缓冲液中，能水解磷酸萘酚钠，并释放出磷酸与萘酚。再以重氮盐与萘酚偶联成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞浆中。$ ]" E) k2 K* y$ V: S( U, ~, v
结果8 A: y8 J% L5 l$ F5 w0 r0 n
坚牢蓝RR阳性为紫黑色颗粒，坚牢紫酱GBC阳性为棕红色沉淀。# b+ s6 }0 n& ?$ ^) T3 r
实验方法
7 k: g- f; G) {* S材料：
; Q9 b4 g, G+ z7 H* g1. 10%甲醛甲醇固定液1 J& d. t( C/ f
    甲醛     10 ml  w, G2 T' k/ O  i" N& H! F0 F
    甲醇     90 ml
. b* H; `  C7 y0 q    20C ~80C避光保存。
+ E9 u9 f2 x* @  \, f1 h   2. 丙二醇缓冲液
1 m+ o1 v- y8 S    (1) 贮备液(0.2 mol/L)' x5 h9 p! T2 t  x" ^  s
    2-氨基-2甲基-1，3-丙二醇             10.5 g& i6 Q6 x  M% |: Y
    蒸馏水                              加至500 mL. ]+ \4 b3 \  k1 o7 o: b
    溶解后保存冰箱内。
/ ^+ R" C% B# K; Z; W+ @    (2) 应用液(0.05 mol/L，pH 9.75)
; ?0 ~% H8 Q- Q5 ^" J3 \    0.2 mol/L贮存液                      25 mL1 K3 {+ D  C: {% [
    0.1 mol/L盐酸                        5 mL) O/ L2 m! ?$ i* Z2 J/ U9 o
    蒸馏水                              加至100mL
2 k% j" t. {- |: X% Y  3. 基质孵育液(pH9.5-9.6)–磷酸萘酚钠20 mg溶于0.05 mol/L丙二醇缓冲液20 mL，再加坚牢紫酱GBC(或重氮坚牢蓝)20 mg混合后用滤纸过滤，用前临时配制。
+ K' p) ?# f6 I. }    方法：
- q. O; R, s+ x) H& ]9 T  1．固定  新鲜干燥的涂片用10%甲醛固定注液固定30s，蒸馏水轻轻冲洗30～60s，待干。
$ b( l" C- d) G  2．显示  把涂片浸入基质孵育液中，在室温下温育10～15min(冬季放孵育箱温育)。蒸馏水冲洗2min。9 j' `1 v5 }0 A7 P4 P
  3．复染  置苏木素复染液复染5～8min，蒸馏水冲洗1～2min，待干，镜检。3 p  `6 H; m9 ?8 r7 J  ~% r, w: T2 d
7 ~2 ?$ ]$ q5 d

南宫燚岚

染色后的颜色根据你所用的kit而定，有的kit是蓝色，有的kit是红色或棕色，具体说明在购买kit时都有的

luoziwei

南京建成的ALP染色液就行，紫色的，又便宜，才180多块