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造成支原体高污染率的原因为：
" Y/ f' s: e, R 1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）
* _# v% M* g' V! P2 E 2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化
9 u" B/ R. @) L1 J3 C+ A! \ 3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式
& R7 ?( `6 g- | 4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染 : s, X% m! H' q. V, a3 @) F1 F
5、研究或操作人员忽略污染问题1 i! Z Z4 _9 `( v0 ]
/ W" x# h9 [ e支原体污染了来源：6 H: P$ D0 h9 g3 h6 Z
1、已受污染的细胞 ; t( P8 X, m7 |7 n0 i! y4 l
2、操作人员的疏失
+ e! v8 T& ~( ]) V. X. L; _, I2 g 3、已受污染的培养基、血清
3 L# y: L3 N! j" B$ ?# g 4、操作环境不良、实验器具不洁等4 ]- `, E4 X1 X+ S
- y/ _2 c( F9 ^由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。
7 t7 I3 w# K% t2 }6 _8 t
9 J; ~; E) l! r/ s3 K1 n去除支原体污染： ) e) D8 D. B4 y
1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer） . i" r$ h% @, j( V. A
2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine ) I( q6 W i4 C) ?
3、Anti-sera 7 j/ d6 Y. u4 y) j8 c9 A& F/ A
0 X7 _, M- T2 i* D) m5 B预防与控制方面可从以下各点加强注意：+ R* N4 l1 q( a
3 ^' W0 p) [% M9 W5 _& g设备方面：
. n8 P- j$ R: \: } 1、使用已作支原体测试ok之细胞株 , i! x, m& }2 g4 @5 o I' [# H, ?$ m
2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞
: t' Z, B1 T2 F$ k2 D2 z! ~3 R 3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞 ) p ]4 y: R7 ^7 T( X$ q/ w
$ J! I w( }; A% R; y, Y
检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。
( o' z# ]7 I2 S: F7 ?
$ |1 I3 K3 P Y实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求, k! K% \5 G& `
7 Q: z% G" d7 o* I7 V
有关支原体污染之问题与回答：
+ ~' n4 I% \: K7 { t$ h# u( {! R! d% Y
1、应如何避免细胞污染？! `3 L! i, Y% A3 Y
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
5 X' m4 M) F$ p. G# j' b
3 m$ M# o; q! V* \/ q2、如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？8 n9 m, }4 o5 P& |
直接灭菌后丢弃之。
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3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
( y, M$ o- i7 v" s( B 不能。 除极有经验之专家外， 大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。& F& J: Y# r# r
. B! ]% B- U9 @9 `2 B2 P9 ?4、支原体污染会对细胞培养有何影响？' Q9 @/ p0 E8 G. ]; Z
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
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% u: j8 N% R+ I e( T8 z; E5、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？1 O# W- u4 [2 z1 b3 V6 x' C% W
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
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+ p; d3 @/ M% w @5 _ c1 a/ W# y支原体之检测：
) N3 S d( ]% K( S' F0 H" P1 P9 e0 E
4 Y* B$ x9 [( |6 ]% D0 V直接培养法 - t) |0 q1 r" ^4 i
1 p$ F/ y+ J" b' s4 l
原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。
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/ s4 E8 W I; |* ~特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。) t0 g! ?) h, q* o/ h z
/ K+ e0 ?. k4 _3 B
缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。
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" G' H" ~# w; S% {& T! v" l材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。）
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培养基制备：
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5 c5 D% V2 n9 }0 O! L基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。$ m: g/ v* i$ k3 ~
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· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。
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2 F5 U$ ^6 _3 |0 {" y6 r· 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。
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% W) X0 V# _! P0 ^( g+ j· 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。
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步骤：
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4 ^/ j& v) P% G/ X8 v) d& p( d· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。
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· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。' @1 Y; C& N6 `; \$ M* {
+ F4 z% S- R6 `/ z4 \* D( K
· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
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/ m& a, i7 T* @* \; U结果判读：
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· 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。4 p l$ Y0 P8 A& D
& T5 }+ ]8 P0 w· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。: D4 c8 K- U8 L8 t/ T
5 u4 @. T+ c. N! R5 u9 ^( [/ ~# n
· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。
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发表于 2012-1-27 13:39
