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回复 cbjonathan 的帖子. J1 U( H5 Z" G) I/ O
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造成支原体高污染率的原因为： ) t* D% |( Y$ m- @0 P
1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）
* m. z4 F! Y/ B7 I8 T9 W, P9 J 2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化
4 R7 ?8 P/ k% P1 X5 E 3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式 , X1 w' }7 X7 i0 A8 X
4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染 * q" y! l" X: {& I/ D* F
5、研究或操作人员忽略污染问题3 @. F4 f) s8 Y5 B4 Y
2 \. ~6 ^6 L+ ]& z
支原体污染了来源：- Q! W1 a9 [$ V9 S* b
1、已受污染的细胞 % n) q$ I3 a7 q) v) u; o6 r% ]' \
2、操作人员的疏失
1 ~8 R! j$ S# a0 c* m) N% m 3、已受污染的培养基、血清
# l* L3 b) S* f( X+ l 4、操作环境不良、实验器具不洁等1 h" r3 u, e3 V r* m0 {
) \* a% F* P- j5 q' i* X S1 }
由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。
, d* N* {& D$ N( _$ L* G4 R5 o+ a6 t: w& @* W: P- ]& \1 k& J) d5 u
去除支原体污染：
8 j. `5 W, G: J 1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer） # x; ^9 a! U5 u* T. J, p' c1 b
2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine
! k+ o W4 @- t' M& W; `$ `" s9 ~7 w/ n 3、Anti-sera 0 U5 W' ?! n( n4 D- b5 s
3 R( p$ L( F' y( n2 y: ~预防与控制方面可从以下各点加强注意：. L, ~2 ^( d4 ~, Q' x* N+ ]* a9 k
! |2 V6 h! c7 z( L z! m设备方面： ( x5 J+ I' A3 H- }/ v
1、使用已作支原体测试ok之细胞株 + b$ D! Y2 V2 Y
2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞
2 r& T: H+ ?' p7 O 3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞 4 L; q# T( s4 V% G5 p) H7 b* P) s
' B+ _" T/ l5 \( O
检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。3 x$ u* n- u* D
- H( A+ k. I7 a' _9 _/ ~( g实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求6 B+ v2 _2 C" r* ~+ }
0 K- w# X' Q( Z# } a
有关支原体污染之问题与回答：( f3 }2 h Y; F" E1 o. j
/ @5 _+ Y* Y+ V3 `1、应如何避免细胞污染？
# l# l7 Q) \: b 细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
6 d$ N* d. A2 e* E( P5 h
3 P5 r% v- r9 ?/ M, B2、如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？1 h* s# u3 Z4 W. C) c" h) d3 K
直接灭菌后丢弃之。
1 |* y, Y8 T B/ ]/ w% z5 F
, F, x+ {7 }5 W( T- Q2 v; o3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
+ \0 U. X. C( c- \ 不能。 除极有经验之专家外， 大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。
3 b) X! c7 s8 a. ~9 D
0 {/ L& u) T' l9 F# J$ |4、支原体污染会对细胞培养有何影响？) A) _6 B( Q; f* n6 y) t
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
: K% P R! e. [! S" c. i; _9 D& H% s$ A: A/ X
5、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？1 G @- R; Y% f# x" j+ P
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
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2 y! g9 E% `: [/ Q支原体之检测：
- K' { E; V6 Z% d0 {8 F2 k) T2 l2 r) \, {9 D
直接培养法 4 W- p7 W. e- V- c5 q) Y" n$ Y
& }' v/ b1 a9 w: A4 ^% Y 原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。
5 l3 r8 p: _5 }7 o: Y, k. p
. U$ O) E& I+ p特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。: D( c4 L u7 u1 t- V6 r
; P" ]; f7 g1 l: c2 Z4 _) ^6 _
缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。
" C; @6 b# y$ l) ]- V4 I8 R- G! K: g8 L6 Q1 q
材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。）
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培养基制备：
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基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
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· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。
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· 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。
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+ y% F1 b4 l- k( R" W. v5 B· 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。
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& {2 P1 p3 V! ^* S& q! V9 }步骤：
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4 F( Q2 t* u' j0 w· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。, c" g" y/ o, U8 _. G' c" m/ C
1 R! p d, E9 i- Z0 a& o· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。
" z# D# V& V- V g) R/ h* b8 m
3 h- K8 i' |; V/ X6 i$ A2 }· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
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. c8 c4 b V! I4 B: U x; K4 M5 Q结果判读： 8 e! x$ d( H7 U8 ~- L5 @+ v5 q5 v
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· 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。
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· 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。! G N' w3 M3 H! W5 p. t
& Y( G6 E& f( l/ k& \; _* i3 [· 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。
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发表于 2012-1-27 13:39
