关于FISH

idealgas

本人最近想要做FISH（荧光原位杂交），因为该技术具有直观性，灵敏度高，并且能够直接在染色体上显示出杂交位点和数目，非常适合外源插入基因、致病基因、染色体分析、转座子研究的检测。但是苦于手头没有资料，并且没有人做过这个实验，所以来论坛里面转转，看有没有大侠给出指教，或者给上部分相关的文献、方法等，从探针设计的原则、实验中需要注意的事项等等方面给出指点。谢谢大家。

hughliang

( M- m( f6 e3 e+ P- ?. R0 c6 _" T- _. C0 g6 B* q! y
严格按这个protocol做，做不出来找我。

ambassador

hughliang 发表于 2012-2-8 16:11 & {% c8 v2 N9 G/ d9 j; I  L
严格按这个protocol做，做不出来找我。

" V2 p) G0 ]; L4 d2 A: y/ R. Z
你好，你这个protocol的资料里面探针设计用的是缺口平移的方法，请问有没有用寡核苷酸链头端标记来做探针的方法？急求！

hughliang

回复 ambassador 的帖子
8 w" i. z7 X, e4 b( j9 q
* J! i& O9 A( G+ q) w& V+ q6 K; B+ m) i这要看您的实验目的。
6 |" _+ X8 N( B
2 q% t! B, l4 B6 a$ I, p  {$ O4 t我这个方案是指标记BAC或PAC克隆检测染色体畸变。由于靶点是单拷贝序列，只能通过缺口平移或随机引物法标记BAC或PAC克隆全长作为探针，否则信号太弱，无法检测。
3 A' s1 `: V* N) _1 |* z; x

ambassador

hughliang 发表于 2012-4-8 13:57
3 {( r0 U& [9 V! D回复 ambassador 的帖子2 i! o  Q1 T; h3 {# T& s: r

3 g" L/ w8 `3 j7 L这要看您的实验目的。

! v0 K' i( H7 Q! c1 W  ^1 ?9 J
嗯，谢谢回复！我只是检测他在染色体的位置以及拷贝数。。请问这个需要特殊的探针吗？普通寡核苷酸链能定位吧？

ambassador

hughliang 发表于 2012-4-8 13:57
2 H; D) D, V7 t9 v6 P7 S回复 ambassador 的帖子
4 ^5 W2 f- ~9 v( Q  X$ T3 e7 m5 q9 ^  C
这要看您的实验目的。

& r" h0 B- B0 F, }* M9 \" m
嗯，谢谢回复！我只是检测他在染色体的位置以及拷贝数。。请问这个需要特殊的探针吗？普通寡核苷酸链能定位吧？

hughliang

回复 ambassador 的帖子
4 n, U' g& g0 p+ }1 y7 d8 g$ s' G4 G5 j9 k: U. M
得看您靶点的长度和拷贝数。: r8 y$ k! c- B3 @: \& q; _
: A% _9 j) `7 H! ^' R' b
如果靶点是单拷贝基因，普通的寡核苷酸探针较短，即便标记探针全长也难以显示；所以得全长标记长达100kb左右的BAC或PAC克隆作探针。! t+ ]5 e/ @  E6 z: M$ n7 {
# t2 K+ e! d# d8 ]9 V5 g8 @* |
如果靶点是多拷贝重复序列，例如染色体着丝粒区域的微卫星重复序列（重复成百上千次），常用的方法是将该重复序列（几百bp）连入质粒，标记后作探针。
$ I4 Q3 E2 Q9 R* `0 D' K/ L3 ]5 E
  n9 j( ~, v& Y: J) c% M$ M) l所以，对于高度重复的序列，可以尝试寡核苷酸探针，但仅头端标记恐怕也难检测到。

weiyepan

头端标记信号不强，除非只是检测miRNA之类的小片段，不然的话一般不用。- B8 q! F0 R+ l+ q% G9 n
标记方法可以用缺口平移，也可以用从头合成，另外按不同的需要分为DNA探针和RNA探针，楼主要的应该是DNA探针，用个klenow掺入标记就很好用，效率很高。可以用aa-UTP，之后喜欢标什么颜色都行，掺入很均匀。如果直接用荧光碱基标，不同的荧光碱基会有不同的混合比例，要慢慢磨条件很恶心。

vividvivid1225

回复 hughliang 的帖子7 ^+ {2 g6 o) P

. s2 T+ N$ x. p" [5 v0 g; b  khughliang你好~! W0 c+ W3 S: T7 t
我对你说的“靶点是多拷贝重复序列，常用方法是将该重复序列连入质粒，标记后做探针”不太明白，能否详细说明？
1 Z/ X2 Y* a* U6 c7 g另外，如何看靶点是否是多拷贝重复序列？是看基因在染色体上的位置是否是在着丝粒区域吗？

细胞海洋

回复 vividvivid1225 的帖子5 e$ n3 r& x% d* |' g( {! e

" t) P$ E8 r2 r1 H) X建议你发新帖提问