慢病毒包装质粒 能否共用？

细胞海洋

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Sushi_Tuang

xiongjiedeng 发表于 2012-2-28 09:57 2 x8 T' X+ N* I" L; k
你用什么细胞制备慢病毒，这其中的原因就比较多了；比如你细胞的状态和密度，包装质粒的用量，还有目的质 ...

: n7 ^6 q0 M/ C  B9 ]# N+ m, |7 ^( q
想请教一下。请问D8.91和VSVG用以包装质粒时。对表达质粒有要求吗？我用的是pCDH-CMV-EF1-copGFP，请问也可以用这个包装系统包出病毒么？期待您的回复。谢谢

刘森泉

谢谢！我在杭州，方便给我一点吗？

xiongjiedeng

回复 刘森泉 的帖子; ~( U& [9 O9 ~/ l- h6 U

( v: w& Q6 u8 Y* m; U, ]' W+ }我们实验室用量比较大，包装质粒都是自己大提出来的，我在长沙，你呢？

刘森泉

xiongjiedeng，您好，太谢谢你了，你也用过delta 8.91和pvsvg包过慢病毒。我对这两个质粒分别酶切跑胶鉴定过，没有问题，但是用感受态做大抽时经常提不出来，不知道何缘故，所以我怀疑了质粒的问题。我也用磷酸钙转染制备慢病毒，293T细胞，我相信包病毒过程没有问题，因为我的对照证明包装成功的。请问你有这两个包装质粒的详细图谱吗？校对下。还有，你地点在哪？可以问你要点包装质粒或者菌吗？谢谢！

164ly

同问，可否共用？

songyang1987

长知识啊

xiongjiedeng

  你用什么细胞制备慢病毒，这其中的原因就比较多了；比如你细胞的状态和密度，包装质粒的用量，还有目的质粒的用量等；下面是我经常用的磷酸钙转染制备慢病毒的方法，包装质粒也是delta 8.91、Pvsvg，从来就没失败过，参考一下: s( `$ B/ p' d" ~$ R% j2 s
磷酸钙转染制备慢病毒2 m, x' j- h) B% I6 S7 K4 @& F
1、 试剂配制7 K) k3 R  b3 H0 `# h/ E
1.1  2×HBS（500ml体系）:
8 c' v& @/ x3 Y& W7 m样品        浓度（mM／L）        质量(g)3 V1 q: H% B# D2 p
NaCl        280mM        8.18g: i* ?6 q+ _. v+ ?% j% r& X% O2 i5 L
KCl        10mM        0.375g
" A9 }8 w# S* r0 M. f% kNa2HPO4          1.5mM        0.1g
* B  U1 ^& ]2 d. i+ T% }9 ?glucose        12mM        1.19g
2 J$ Q5 o, E4 RHEPES          50mM        5.95g( b3 R4 Q4 e; F
        配好pH在6左右，用NaOH调到7.4，加ddH2O 至 500ml 灭菌  K. m; u* V! M: u
        1.2  2M CaCl2    二水氯化钙 58.8g  加ddH2O 至200ml
& _6 p, a4 d$ W& q! J7 r        2、转染步骤
6 X. o7 ]/ {8 R$ I        （1）、10cm盘293T细胞，50-70%铺满率转染
! @+ T9 c& s7 e5 W （2）  将下列3种组分混匀
" N& S0 a2 h) ^% B试剂        体质或质量) F3 L6 r) T- |3 F& Z8 f1 `
灭菌超纯水H2O        600ul( M, S( z$ E: V. L* C
Plasmid（质粒）9 o; a1 D8 Q3 W0 t' R
（共270ul）        cDNA（目的质粒）          12ug- _3 l, _, n2 u, P2 o
        delta 8.91（包装）        9ug: a7 R" u, v  A. n5 B
        Pvsvg（保证）        6ug9 X! b- m- t9 H7 ]9 \, ?
2M CaCl2        132ul5 X( d" ^& _  [# s% u9 [' U
        （3） 加1000ul的2×HBS ，再吹打50次，充分混匀，立即加入培养皿摇匀，6-8小时换新鲜培养基即可
5 V* Y% Z" W$ n* t（4） 48小时和96小时分别收集上清即可