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你用什么细胞制备慢病毒，这其中的原因就比较多了；比如你细胞的状态和密度，包装质粒的用量，还有目的质粒的用量等；下面是我经常用的磷酸钙转染制备慢病毒的方法，包装质粒也是delta 8.91、Pvsvg，从来就没失败过，参考一下; s" I* N7 A' y, k" g- D
磷酸钙转染制备慢病毒
( H3 P( M; G) f9 r% }8 s. p1、 试剂配制
# |* f9 n/ g$ N1.1 2×HBS（500ml体系）:/ ?' F( z$ x0 E2 d; r3 j+ s* W
样品 浓度（mM／L） 质量(g) e/ U9 D( E' c4 P' O' M
NaCl 280mM 8.18g
- X# j; I$ b4 e; V9 j6 yKCl 10mM 0.375g
0 {- b; z' \. A; lNa2HPO4 1.5mM 0.1g
9 K [0 x/ ?3 b: Cglucose 12mM 1.19g
* z2 J! ~; G/ N* q/ O5 ~, v* G3 {HEPES 50mM 5.95g/ ^# [5 q' Z* E4 A' C0 {/ `
配好pH在6左右，用NaOH调到7.4，加ddH2O 至 500ml 灭菌
+ Q2 Q W3 {0 l$ a0 V! n8 i% j 1.2 2M CaCl2 二水氯化钙 58.8g 加ddH2O 至200ml
8 C% J! k' J4 }" h3 S2 t 2、转染步骤* _4 P* p. B: u) n
（1）、10cm盘293T细胞，50-70%铺满率转染1 K/ E' Q7 h$ S& D8 o# Y
（2） 将下列3种组分混匀
: g6 D# L, k" H* ]) ^0 l4 E* z& ?( L试剂 体质或质量
6 S/ B- L3 k1 a6 G' w灭菌超纯水H2O 600ul0 ]2 |+ X; D, A1 D
Plasmid（质粒）/ q8 e0 e, M1 y) x
（共270ul） cDNA（目的质粒） 12ug6 b- [; ^3 d {' B! B
delta 8.91（包装） 9ug
) s& R# s, h. P! I$ x Pvsvg（保证） 6ug6 b# i( ?8 ~! Y
2M CaCl2 132ul
6 N6 B7 _7 N; G4 W0 f- ` （3） 加1000ul的2×HBS ，再吹打50次，充分混匀，立即加入培养皿摇匀，6-8小时换新鲜培养基即可1 a2 B; K; G0 P4 k
（4） 48小时和96小时分别收集上清即可 |
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发表于 2012-2-28 09:33
发表于 2013-10-9 11:19
