请教大侠们实验设计方面的问题

懵懂干细胞

1、2009年浙大分子考了一个这样的题目：有一个蛋白X，发现其在血管内皮细胞中与信号转导通路A有密切联系，如何证明在此细胞中与蛋白X相互作用的蛋白。5 S/ e) ~5 |) t8 s) G/ h
2、如果某信号对某蛋白有作用，设计一个试验来确定这条信号通路。5 P9 l7 K5 c) n1 G/ T- I4 D3 j
3、设计一个试验了解整个信号通路的传递过程。) [/ E  Z$ W3 u
还望大侠指教！！小弟感激不尽

zzc2211

8 Z" I) _3 K! M
: [  m) K4 A$ O8 v9 Z% y7 F可能是版主为提升大家的讨论学习气氛发起的吧，同求大侠指点，如版主知道答案，请不吝赐教，共同学习。本人想法如下，前提：蛋白X---可能与---信号通路A。通过免疫共沉淀（或GST-PULLDOWN）得到蛋白复合物，Western blot检测A通路上的标志性蛋白。（或刺激后免疫荧光观测X和A通路标志蛋白的共定位）。如得到阳性结果，则需进一步证明X和标志蛋白的上下游关系。把X knockdown观察标志蛋白的变化和蛋白带来的功能变化，继而还会有Real-time-PCR，报告基因或酵母双杂交。如没有这个前提，更复杂吧。关于第二个问题：A蛋白受B通路影响，C为B通路的刺激因子，D为B通路的阻断因子。分别加入C刺激和D阻断，western bolt 观察A蛋白的变化，对比区别。如果哪位大侠知道答案，请不吝赐教。

yyshpy

楼上说的有道理，但是做起来可行性还是值得怀疑的，知道蛋白X，首先做生物信息学分析，去发现可能的蛋白，再加上参与信号通路，可以选择通路抑制剂处理，寻找相关信号通路，两者结合，比较容易确定与蛋白X结合的蛋白A了，然后做免疫共沉淀，免疫荧光之类的实验去确定，之后就比较容易了
* c0 H" ^! Z. C  c个人一点拙见啊

holywater

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5 Q; j, @. T& T) |$ Y. M+ s
" ~; a. ]5 O" y7 C6 S3 \2楼的做法有很大漏洞。 1--并不一定是蛋白=蛋白直接相互作用 ，不是直接的怎么PULL' J+ E0 b% I/ q0 b7 c
: k: T, V4 E' K. o$ W$ v
2=就是能拉下来，western抗体挨个杂吗？1 }7 f. b; @$ F" `4 e

$ m4 i+ C0 v6 \6 D3 如果是蛋白直接作用，realtime起什么作用？
% [) t) O- Z7 l/ j. h% w# i- e# H* e! s
要我是老师，这题目你肯定0分嘛

holywater

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) z5 z( n2 }1 G$ x" d2 ]
4 M; A2 h# Z$ s- ~0 \4 \4 @3楼说的有道理，但是有个最大问题，生物信息学经常不准的，否则生物信息学家早就统治世界了。不过思路是好的，至少可以得30分/100分的话5 r6 v8 o  \$ {

hany2007

有一个蛋白X，发现其在血管内皮细胞中与信号转导通路A有密切联系，如何证明在此细胞中与蛋白X相互作用的蛋白。: Q6 d6 l  _, w% Y( p$ K! q
1.用X蛋白的抗体做免疫共沉淀后，跑sds-page，染色后去打质谱，确定与其相互作用的蛋白。
3 p4 b" P; j" V2.打谱结果出来后，再次以flag或myc或ha标签质粒克隆候选基因，再次做CO-IP验证。
+ o* B& x5 q9 C- _5 F3.验证出来后，用截断体或点突变确定结合位点。

holywater

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, d7 v, b8 [4 {+ Q2 m7 t7 n也是同样的问题，如果蛋白不是通过直接作用来影响通路，你实验做死了也没结果嘛。

holywater

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; U) Q# b" v" `3 g- J9 Z) H  x6 S8 t  M1 R
还有个问题，一个蛋白可能影响很多通路呢，你有可能杂出一堆蛋白。

holywater

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holywater

" A( P6 g# f( p8 V  k& K" A: h; w! _2 Y6 d: j& O
如果蛋白A可以和蛋白B,C,D作用，而D是你要的通路，但是蛋白和B亲和力很高，而B的丰度又很高，D又低的时候，你有可能做出的结果就是蛋白A和B作用。pulldown不是那么严格的东西，它可以用来验证两个蛋白是否作用，但是不能来验证两个蛋白不作用。不知道我说的大家明白不