请教大侠们实验设计方面的问题

懵懂干细胞

1、2009年浙大分子考了一个这样的题目：有一个蛋白X，发现其在血管内皮细胞中与信号转导通路A有密切联系，如何证明在此细胞中与蛋白X相互作用的蛋白。/ ~# R6 D( V7 V8 i: n
2、如果某信号对某蛋白有作用，设计一个试验来确定这条信号通路。3 p, u* C. J: z8 {5 A
3、设计一个试验了解整个信号通路的传递过程。! k7 E0 J5 E& J7 f, M
还望大侠指教！！小弟感激不尽

zzc2211

/ j2 a, Y! X" t

' G( R, F5 R/ T# k& r+ \* [9 N# u/ u可能是版主为提升大家的讨论学习气氛发起的吧，同求大侠指点，如版主知道答案，请不吝赐教，共同学习。本人想法如下，前提：蛋白X---可能与---信号通路A。通过免疫共沉淀（或GST-PULLDOWN）得到蛋白复合物，Western blot检测A通路上的标志性蛋白。（或刺激后免疫荧光观测X和A通路标志蛋白的共定位）。如得到阳性结果，则需进一步证明X和标志蛋白的上下游关系。把X knockdown观察标志蛋白的变化和蛋白带来的功能变化，继而还会有Real-time-PCR，报告基因或酵母双杂交。如没有这个前提，更复杂吧。关于第二个问题：A蛋白受B通路影响，C为B通路的刺激因子，D为B通路的阻断因子。分别加入C刺激和D阻断，western bolt 观察A蛋白的变化，对比区别。如果哪位大侠知道答案，请不吝赐教。

yyshpy

楼上说的有道理，但是做起来可行性还是值得怀疑的，知道蛋白X，首先做生物信息学分析，去发现可能的蛋白，再加上参与信号通路，可以选择通路抑制剂处理，寻找相关信号通路，两者结合，比较容易确定与蛋白X结合的蛋白A了，然后做免疫共沉淀，免疫荧光之类的实验去确定，之后就比较容易了
! z* X$ Z, ?( b& [, U. Z个人一点拙见啊

holywater

回复 zzc2211 的帖子" }2 U2 ?0 Q7 P/ B( `; @0 X
, J- e* E+ O* T2 H. E+ @; r
2楼的做法有很大漏洞。 1--并不一定是蛋白=蛋白直接相互作用 ，不是直接的怎么PULL
8 I$ \: L. d  I' v; i
- ]8 S- {2 [+ V+ ^) Q; T" A' L2 @2=就是能拉下来，western抗体挨个杂吗？: c4 N, @6 t7 k( _) u; M8 V: y( \

7 @. t- P+ l: ?+ v9 }( R/ t8 f3 如果是蛋白直接作用，realtime起什么作用？
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要我是老师，这题目你肯定0分嘛

holywater

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; F3 ^) k- p5 L. U8 r9 w9 T' {# h+ G! T% ]$ K0 C
3楼说的有道理，但是有个最大问题，生物信息学经常不准的，否则生物信息学家早就统治世界了。不过思路是好的，至少可以得30分/100分的话
8 _, g  v* b) G* d+ \; X- U

hany2007

有一个蛋白X，发现其在血管内皮细胞中与信号转导通路A有密切联系，如何证明在此细胞中与蛋白X相互作用的蛋白。% _7 b5 A/ Z! |7 R) z
1.用X蛋白的抗体做免疫共沉淀后，跑sds-page，染色后去打质谱，确定与其相互作用的蛋白。
& v5 K3 \% R/ m5 r5 G& s2.打谱结果出来后，再次以flag或myc或ha标签质粒克隆候选基因，再次做CO-IP验证。* z, i7 z9 Q/ Q+ k' t
3.验证出来后，用截断体或点突变确定结合位点。

holywater

回复 hany2007 的帖子" t2 M3 b$ y9 n/ g  H
5 K# u! ?* Y! ^9 S, X
也是同样的问题，如果蛋白不是通过直接作用来影响通路，你实验做死了也没结果嘛。

holywater

回复 hany2007 的帖子/ _) p! m4 m- N

2 u) b4 X6 d) d' b3 w还有个问题，一个蛋白可能影响很多通路呢，你有可能杂出一堆蛋白。

holywater

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holywater

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0 V1 n6 w1 D: V* q
如果蛋白A可以和蛋白B,C,D作用，而D是你要的通路，但是蛋白和B亲和力很高，而B的丰度又很高，D又低的时候，你有可能做出的结果就是蛋白A和B作用。pulldown不是那么严格的东西，它可以用来验证两个蛋白是否作用，但是不能来验证两个蛋白不作用。不知道我说的大家明白不