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回复 细胞干 的帖子9 y4 f3 A5 }9 h; C6 B" a
7 o/ n1 x, i# c" ?6 | 大部分都差不多,就是在消化上有点不同,这是我的做法
/ y+ V4 u$ n h
0 W1 O+ O6 o. gWharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的! O( {- c' O. m# k, J9 [4 r
小烧杯中,置于37度恒温培养箱中消化4-6h
% p3 R( S2 j3 F+ J' [$ b! \: q 加入适当体积的PBSA(PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白,即BSA),一般是& x8 \1 u) o7 h7 o+ [3 j0 x
胶原酶溶液体积的2倍,250g离心5分钟。
8 f, f C; [3 {* V7 ?9 P 弃上清液,加入2.5%胰蛋白酶(大约是沉淀物体积的2倍),37度处理30
: K8 p" @: p$ h3 r& t& R. |& w: a' k分钟,轻轻摇动。! `: |5 C3 G; |+ l) A# O/ K/ ]+ o
加入适当体积的FBS(消化酶体积的10%)中止消化。5 F: Q. m" N+ e' V* V
1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次. n, a0 d& C0 h, \3 |7 C
用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少 z- d; x- |# E2 Z
许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在6 f/ ~8 [; @. [: B: g
1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.
* B; T# O3 k/ c: { ^ ^, M+ y8 o4 y5 w6 S& E; o
我想,你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心,再加入胰酶消化,还有就是消化完组织后,要清洗细胞,这个很重要,把残留的胰酶清洗掉0 e: p1 `" l$ O5 x
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