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回复 细胞干 的帖子
A- Q% F2 j0 c+ V0 L$ e! R! X' d; M! z& W, V7 M) p
大部分都差不多,就是在消化上有点不同,这是我的做法' Q b, p/ @- P, ?% u0 J2 j
- S S! }0 I* m: u" xWharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的3 I a# C5 E# m1 Y1 Z0 Z( ~8 A- `! ] F
小烧杯中,置于37度恒温培养箱中消化4-6h9 w# F- P9 C' M9 ]
加入适当体积的PBSA(PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白,即BSA),一般是: H9 v* p) a% n: c
胶原酶溶液体积的2倍,250g离心5分钟。; E, a- l- E5 }/ q0 g
弃上清液,加入2.5%胰蛋白酶(大约是沉淀物体积的2倍),37度处理30
. D2 X* H- ] o0 Y3 N: O/ O1 E分钟,轻轻摇动。5 M5 i5 }3 \: B, J+ E
加入适当体积的FBS(消化酶体积的10%)中止消化。
9 o$ r. i. H' Y) p+ m/ [& L 1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.
( e% B& l- \8 F" S$ x; N 用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少. h0 [: `* P2 j) j" }
许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在
' X( K( x$ r0 n2 s2 _3 d7 L3 w9 ^. U1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.
' U ?# O% k- n9 c+ J
2 m+ G9 h; b8 V# h! i: B0 a( v 我想,你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心,再加入胰酶消化,还有就是消化完组织后,要清洗细胞,这个很重要,把残留的胰酶清洗掉
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