请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题

细胞干

我用的是0.1%二型胶原酶消化4小时，0.25%胰酶消化30min，但是细胞养几天就死了，请问是不是胰酶消化时间太长，过度消化所致啊？

yingjie

这个说不定的，根据你胰酶和胶原酶浓度和消化时间不应该是消化过度的问题，如果你的消化酶没什么问题的话，就查查你的培养基有没有问题，用的是DMEM/F12培养基吗?还有你培养基中加了些什么,一般10%FBS,双抗100单位/ml,谷氨酰胺1%,还有碳酸氢钠.也不知道你是怎么操作的,很难说,能说下你的做细胞过程吗

pailishi

我们是三种酶混合过夜消化呢，效果很好的

nek314

接种细胞有多少呢？换过液么？我觉得原代的时候细胞多一点比较好，首次换液培养时间长一些，换的时候半量或者1/3好一点。

赵贵芳

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) n1 n- C- n: s" F
请问是哪三种酶啊？

细胞干

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; n: V! o4 B- _' y; e# ^" f& S4 a1 W- }$ Z* U
我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS，也是加100U/ml双抗。
/ B& ^. j( T7 a8 Y) w我的做法是脐带拔胶后，盲剪剪碎，然后加0.1%二型胶原酶消化4h，这个时候组织比较松散了，然后再直接加0.25%胰酶消化30min，这个时候组织块已经很少了。终止消化，加PBS稀释10~20倍，过滤。
' @& E. t$ ?/ u0 t+ [消化液梯度离心（2500rpm 15min，1500rpm 15min，800rpm 10min）。
$ \" F! F% x7 a$ }8 }0 }0 e但是做下来，感觉得到的细胞不多，而且细胞基本都不贴壁，过几天都死了。
6 e  K9 i; p  m" y) {2 v8 _/ n请问你是怎么做的，结果怎么样？- Y+ [8 E+ ~+ d7 v" x( {$ O

细胞干

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2 M: U$ |1 ^5 k: s  c& z, Y是那三种酶啊，消化时间多少啊？请问你消化得到的细胞多吗？几天贴壁？

yingjie

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  A- Q% F2 j0 c+ V0 L$ e! R! X' d; M! z& W, V7 M) p
大部分都差不多，就是在消化上有点不同，这是我的做法' Q  b, p/ @- P, ?% u0 J2 j

- S  S! }0 I* m: u" xWharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的3 I  a# C5 E# m1 Y1 Z0 Z( ~8 A- `! ]  F
小烧杯中，置于37度恒温培养箱中消化4-6h9 w# F- P9 C' M9 ]
    加入适当体积的PBSA（PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，即BSA），一般是: H9 v* p) a% n: c
胶原酶溶液体积的2倍，250g离心5分钟。; E, a- l- E5 }/ q0 g
    弃上清液，加入2.5%胰蛋白酶（大约是沉淀物体积的2倍），37度处理30
. D2 X* H- ]  o0 Y3 N: O/ O1 E分钟，轻轻摇动。5 M5 i5 }3 \: B, J+ E
    加入适当体积的FBS（消化酶体积的10%）中止消化。
9 o$ r. i. H' Y) p+ m/ [& L    1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.
( e% B& l- \8 F" S$ x; N    用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少. h0 [: `* P2 j) j" }
许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在
' X( K( x$ r0 n2 s2 _3 d7 L3 w9 ^. U1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.
' U  ?# O% k- n9 c+ J
2 m+ G9 h; b8 V# h! i: B0 a( v     我想，你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心，再加入胰酶消化，还有就是消化完组织后，要清洗细胞，这个很重要，把残留的胰酶清洗掉
8 \! Y1 f& ~+ S/ u% z" x7 ]; F

上官冰梦

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$ e& p" n- I1 ~; {. h8 y
为什么选择二型胶原酶啊？一型不行吗？我也是刚准备做这个用的是一型

细胞干

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0 x5 [0 z& }& ?0 b0 X$ C$ O  _
, Q+ w! A' G/ J* N+ e* i请问yingjie：1.胶原酶消化、离心后，上清会不会分层啊，因为胶原比较粘稠，弃上清是把所有的上清都弃掉吗？会不会损失细胞啊？3 b& ]3 M! W% e" v  r4 _
2.胰酶消化终止后不要过滤吗？还是先过滤再离心啊？