请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题

细胞干

我用的是0.1%二型胶原酶消化4小时，0.25%胰酶消化30min，但是细胞养几天就死了，请问是不是胰酶消化时间太长，过度消化所致啊？

yingjie

这个说不定的，根据你胰酶和胶原酶浓度和消化时间不应该是消化过度的问题，如果你的消化酶没什么问题的话，就查查你的培养基有没有问题，用的是DMEM/F12培养基吗?还有你培养基中加了些什么,一般10%FBS,双抗100单位/ml,谷氨酰胺1%,还有碳酸氢钠.也不知道你是怎么操作的,很难说,能说下你的做细胞过程吗

pailishi

我们是三种酶混合过夜消化呢，效果很好的

nek314

接种细胞有多少呢？换过液么？我觉得原代的时候细胞多一点比较好，首次换液培养时间长一些，换的时候半量或者1/3好一点。

赵贵芳

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- j9 @3 E1 C9 A8 G请问是哪三种酶啊？

细胞干

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! A$ z1 X% y! v% S6 I6 m
我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS，也是加100U/ml双抗。
: C( [3 y; J, j7 g9 r' V我的做法是脐带拔胶后，盲剪剪碎，然后加0.1%二型胶原酶消化4h，这个时候组织比较松散了，然后再直接加0.25%胰酶消化30min，这个时候组织块已经很少了。终止消化，加PBS稀释10~20倍，过滤。
! n! E) R1 d% t: I; L- B( ~7 `消化液梯度离心（2500rpm 15min，1500rpm 15min，800rpm 10min）。3 _( h" t' w/ U
但是做下来，感觉得到的细胞不多，而且细胞基本都不贴壁，过几天都死了。
/ y1 a) w# n) D请问你是怎么做的，结果怎么样？
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细胞干

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6 U4 K) s# z! i. t' Z5 u- e) m6 b$ Y
是那三种酶啊，消化时间多少啊？请问你消化得到的细胞多吗？几天贴壁？

yingjie

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# K8 b! t: G- m  p: ^+ {3 M  g) @5 ]: g. W) l
大部分都差不多，就是在消化上有点不同，这是我的做法2 y0 I( a* P0 ]. j$ D+ u. W

+ x% C5 Y& B( o( P/ AWharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的4 b, i% B# A5 B' a
小烧杯中，置于37度恒温培养箱中消化4-6h- Y6 c5 t. u# P8 J$ Z$ `8 h
    加入适当体积的PBSA（PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，即BSA），一般是
; l+ w4 A% K4 R' ]3 e! j胶原酶溶液体积的2倍，250g离心5分钟。
3 y, x/ R, p! Q+ t8 z    弃上清液，加入2.5%胰蛋白酶（大约是沉淀物体积的2倍），37度处理30
3 G# ~. S$ g! O' F分钟，轻轻摇动。9 B+ C" u- L2 L) N2 A6 w
    加入适当体积的FBS（消化酶体积的10%）中止消化。/ q# z2 b1 U- X5 p8 a# |. ~1 z; M
    1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.( y" T2 O; k: @) T+ p1 _
    用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少
2 U9 R! @  `6 u) M# Z许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在3 H8 W6 [* D" o6 S) b2 I$ [% C
1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.
9 c2 Q: V! L- ]4 Y" e8 x2 L% x# i1 ~) u1 S* g
     我想，你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心，再加入胰酶消化，还有就是消化完组织后，要清洗细胞，这个很重要，把残留的胰酶清洗掉! z/ ?- }1 ^, D5 E' C: |

上官冰梦

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1 E5 ~9 }8 ?$ t% U( G
2 Y3 A5 v4 C- Z1 U为什么选择二型胶原酶啊？一型不行吗？我也是刚准备做这个用的是一型

细胞干

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- [' G# K- J+ o( l4 d7 Z6 }, b
请问yingjie：1.胶原酶消化、离心后，上清会不会分层啊，因为胶原比较粘稠，弃上清是把所有的上清都弃掉吗？会不会损失细胞啊？/ x+ n) q7 N6 P3 h
2.胰酶消化终止后不要过滤吗？还是先过滤再离心啊？