干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

 

 

搜索
朗日生物

免疫细胞治疗专区

欢迎关注干细胞微信公众号

  
查看: 48810|回复: 20
go

请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题   [复制链接]

Rank: 1

积分
49 
威望
49  
包包
217  
楼主
发表于 2012-3-20 08:16 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
我用的是0.1%二型胶原酶消化4小时,0.25%胰酶消化30min,但是细胞养几天就死了,请问是不是胰酶消化时间太长,过度消化所致啊?
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 2 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 2  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 2

积分
221 
威望
221  
包包
619  

优秀会员

沙发
发表于 2012-3-20 10:05 |只看该作者
这个说不定的,根据你胰酶和胶原酶浓度和消化时间不应该是消化过度的问题,如果你的消化酶没什么问题的话,就查查你的培养基有没有问题,用的是DMEM/F12培养基吗?还有你培养基中加了些什么,一般10%FBS,双抗100单位/ml,谷氨酰胺1%,还有碳酸氢钠.也不知道你是怎么操作的,很难说,能说下你的做细胞过程吗
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 6 + 15 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 6  包包 + 15   查看全部评分

Rank: 3Rank: 3

积分
455 
威望
455  
包包
463  

金话筒 优秀会员

藤椅
发表于 2012-3-20 11:27 |只看该作者
我们是三种酶混合过夜消化呢,效果很好的
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 2 + 5 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 2  包包 + 5   查看全部评分

Rank: 2

积分
299 
威望
299  
包包
758  

金话筒 优秀会员 积极份子 小小研究员

板凳
发表于 2012-3-20 13:37 |只看该作者
干细胞之家微信公众号
接种细胞有多少呢?换过液么?我觉得原代的时候细胞多一点比较好,首次换液培养时间长一些,换的时候半量或者1/3好一点。
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 5 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 5  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 1

积分
威望
3  
包包
17  
报纸
发表于 2012-3-20 16:08 |只看该作者
回复 pailishi 的帖子
5 D# g; ~+ n3 I2 U4 j' x2 \. \* {; O6 s' U. y( m- s6 ?. [! d3 H
请问是哪三种酶啊?

Rank: 1

积分
49 
威望
49  
包包
217  
地板
发表于 2012-3-20 20:30 |只看该作者
回复 yingjie 的帖子
9 r" _- \# f' n3 f  z$ `- T; h& f! P1 W& y. K3 V5 Y
我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS,也是加100U/ml双抗。
$ ^8 w* Z" n% ]6 _# i# Z" I- A我的做法是脐带拔胶后,盲剪剪碎,然后加0.1%二型胶原酶消化4h,这个时候组织比较松散了,然后再直接加0.25%胰酶消化30min,这个时候组织块已经很少了。终止消化,加PBS稀释10~20倍,过滤。
8 B* I- [0 v) M/ f% {/ f消化液梯度离心(2500rpm 15min,1500rpm 15min,800rpm 10min)。2 q& s/ D  ^% e
但是做下来,感觉得到的细胞不多,而且细胞基本都不贴壁,过几天都死了。
8 p2 ?$ n/ U% ~' E; J0 R- O请问你是怎么做的,结果怎么样?' }. u* t5 D6 `- |
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 5 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 5  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 1

积分
49 
威望
49  
包包
217  
7
发表于 2012-3-20 20:31 |只看该作者
回复 pailishi 的帖子6 B" _& S/ X/ I7 y! ]

. p1 u/ v4 n9 c3 P5 y4 e. X* e是那三种酶啊,消化时间多少啊?请问你消化得到的细胞多吗?几天贴壁?
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 1 + 5 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 1  包包 + 5   查看全部评分

Rank: 2

积分
221 
威望
221  
包包
619  

优秀会员

8
发表于 2012-3-21 09:29 |只看该作者
回复 细胞干 的帖子9 y4 f3 A5 }9 h; C6 B" a

7 o/ n1 x, i# c" ?6 | 大部分都差不多,就是在消化上有点不同,这是我的做法
/ y+ V4 u$ n  h
0 W1 O+ O6 o. gWharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的! O( {- c' O. m# k, J9 [4 r
小烧杯中,置于37度恒温培养箱中消化4-6h
% p3 R( S2 j3 F+ J' [$ b! \: q    加入适当体积的PBSA(PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白,即BSA),一般是& x8 \1 u) o7 h7 o+ [3 j0 x
胶原酶溶液体积的2倍,250g离心5分钟。
8 f, f  C; [3 {* V7 ?9 P    弃上清液,加入2.5%胰蛋白酶(大约是沉淀物体积的2倍),37度处理30
: K8 p" @: p$ h3 r& t& R. |& w: a' k分钟,轻轻摇动。! `: |5 C3 G; |+ l) A# O/ K/ ]+ o
    加入适当体积的FBS(消化酶体积的10%)中止消化。5 F: Q. m" N+ e' V* V
    1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.  n, a0 d& C0 h, \3 |7 C
    用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少  z- d; x- |# E2 Z
许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在6 f/ ~8 [; @. [: B: g
1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.
* B; T# O3 k/ c: {  ^  ^, M+ y8 o4 y5 w6 S& E; o
     我想,你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心,再加入胰酶消化,还有就是消化完组织后,要清洗细胞,这个很重要,把残留的胰酶清洗掉0 e: p1 `" l$ O5 x
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 20 + 40 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 20  包包 + 40   查看全部评分

Rank: 1

积分
13 
威望
13  
包包
88  
9
发表于 2012-3-23 22:32 |只看该作者
回复 细胞干 的帖子
  ~. }: z$ ~3 y( x5 W' v# `3 W3 |6 `  e) ?$ M2 q
为什么选择二型胶原酶啊?一型不行吗?我也是刚准备做这个用的是一型
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 1 + 5 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 1  包包 + 5   查看全部评分

Rank: 1

积分
49 
威望
49  
包包
217  
10
发表于 2012-4-5 15:22 |只看该作者
回复 yingjie 的帖子
1 y" O; A6 s# t/ l
, q6 @0 K# Z. M* ?, h. q请问yingjie:1.胶原酶消化、离心后,上清会不会分层啊,因为胶原比较粘稠,弃上清是把所有的上清都弃掉吗?会不会损失细胞啊?
# W$ @( B! B8 c) w$ Q6 T2.胰酶消化终止后不要过滤吗?还是先过滤再离心啊?
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 2 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 2  包包 + 10   查看全部评分

‹ 上一主题|下一主题
你需要登录后才可以回帖 登录 | 注册
验证问答 换一个

Archiver|干细胞之家 ( 吉ICP备2021004615号-3 )

GMT+8, 2025-6-16 06:53

Powered by Discuz! X1.5

© 2001-2010 Comsenz Inc.