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回复 细胞干 的帖子
# K8 b! t: G- m p: ^+ {3 M g) @5 ]: g. W) l
大部分都差不多,就是在消化上有点不同,这是我的做法2 y0 I( a* P0 ]. j$ D+ u. W
+ x% C5 Y& B( o( P/ AWharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的4 b, i% B# A5 B' a
小烧杯中,置于37度恒温培养箱中消化4-6h- Y6 c5 t. u# P8 J$ Z$ `8 h
加入适当体积的PBSA(PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白,即BSA),一般是
; l+ w4 A% K4 R' ]3 e! j胶原酶溶液体积的2倍,250g离心5分钟。
3 y, x/ R, p! Q+ t8 z 弃上清液,加入2.5%胰蛋白酶(大约是沉淀物体积的2倍),37度处理30
3 G# ~. S$ g! O' F分钟,轻轻摇动。9 B+ C" u- L2 L) N2 A6 w
加入适当体积的FBS(消化酶体积的10%)中止消化。/ q# z2 b1 U- X5 p8 a# |. ~1 z; M
1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.( y" T2 O; k: @) T+ p1 _
用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少
2 U9 R! @ `6 u) M# Z许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在3 H8 W6 [* D" o6 S) b2 I$ [% C
1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.
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我想,你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心,再加入胰酶消化,还有就是消化完组织后,要清洗细胞,这个很重要,把残留的胰酶清洗掉! z/ ?- }1 ^, D5 E' C: |
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