请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题

细胞干

我用的是0.1%二型胶原酶消化4小时，0.25%胰酶消化30min，但是细胞养几天就死了，请问是不是胰酶消化时间太长，过度消化所致啊？

yingjie

这个说不定的，根据你胰酶和胶原酶浓度和消化时间不应该是消化过度的问题，如果你的消化酶没什么问题的话，就查查你的培养基有没有问题，用的是DMEM/F12培养基吗?还有你培养基中加了些什么,一般10%FBS,双抗100单位/ml,谷氨酰胺1%,还有碳酸氢钠.也不知道你是怎么操作的,很难说,能说下你的做细胞过程吗

pailishi

我们是三种酶混合过夜消化呢，效果很好的

nek314

接种细胞有多少呢？换过液么？我觉得原代的时候细胞多一点比较好，首次换液培养时间长一些，换的时候半量或者1/3好一点。

赵贵芳

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# y6 m  V2 |9 o9 f" `2 B. N
请问是哪三种酶啊？

细胞干

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, ?% Q7 g# P" {' ^$ [* `" ^; u
2 p: a# U5 h! ?我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS，也是加100U/ml双抗。
' U8 b# @5 p5 M, v" ~7 q我的做法是脐带拔胶后，盲剪剪碎，然后加0.1%二型胶原酶消化4h，这个时候组织比较松散了，然后再直接加0.25%胰酶消化30min，这个时候组织块已经很少了。终止消化，加PBS稀释10~20倍，过滤。
9 Z4 ]$ Y: j3 i. F# W/ r3 v消化液梯度离心（2500rpm 15min，1500rpm 15min，800rpm 10min）。% j2 `! F5 I7 b! k
但是做下来，感觉得到的细胞不多，而且细胞基本都不贴壁，过几天都死了。
+ `! N' X* l8 f% D0 }! E1 G9 X请问你是怎么做的，结果怎么样？  K, h3 a; @# H7 x+ U4 [

细胞干

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) o# v" Z: }# f. k( G8 q0 ?# M" W7 @5 E
是那三种酶啊，消化时间多少啊？请问你消化得到的细胞多吗？几天贴壁？

yingjie

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6 w" ]2 L- e* a" Q, d1 b
大部分都差不多，就是在消化上有点不同，这是我的做法
1 `, T8 `- R! R, v# ^0 n6 s/ D/ C& v) o" q- F
Wharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的) }8 e6 P; C! m, G4 @7 h
小烧杯中，置于37度恒温培养箱中消化4-6h0 `: Y+ N4 J" k( Y! ?/ w7 L
    加入适当体积的PBSA（PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，即BSA），一般是
! ^: L  s) N7 t, h$ m胶原酶溶液体积的2倍，250g离心5分钟。5 B1 U/ A2 T( O
    弃上清液，加入2.5%胰蛋白酶（大约是沉淀物体积的2倍），37度处理30% V: O* f7 T# J1 u7 R! r
分钟，轻轻摇动。( k' p3 T- `; }$ o) z* Z' w$ k. \
    加入适当体积的FBS（消化酶体积的10%）中止消化。( u, E1 D, w: P: a, T
    1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.% t, x* E; i, e0 G4 U
    用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少
5 n( ]* |0 E3 k5 m. E% A8 Y0 m许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在
( @/ y9 t' A4 |; U. Q4 d( r1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养./ h  q) \+ O1 u) \

0 K; I& p3 V" I% @     我想，你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心，再加入胰酶消化，还有就是消化完组织后，要清洗细胞，这个很重要，把残留的胰酶清洗掉
0 ~3 D0 F0 M2 _0 n' c2 C% K, g8 V! S

上官冰梦

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9 m. U/ a6 x  U8 \为什么选择二型胶原酶啊？一型不行吗？我也是刚准备做这个用的是一型

细胞干

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: G3 X; ?: W; ?; }& e/ W/ T
请问yingjie：1.胶原酶消化、离心后，上清会不会分层啊，因为胶原比较粘稠，弃上清是把所有的上清都弃掉吗？会不会损失细胞啊？0 N% j+ `# ?3 q& g# L" }1 A
2.胰酶消化终止后不要过滤吗？还是先过滤再离心啊？