请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题

细胞干

我用的是0.1%二型胶原酶消化4小时，0.25%胰酶消化30min，但是细胞养几天就死了，请问是不是胰酶消化时间太长，过度消化所致啊？

yingjie

这个说不定的，根据你胰酶和胶原酶浓度和消化时间不应该是消化过度的问题，如果你的消化酶没什么问题的话，就查查你的培养基有没有问题，用的是DMEM/F12培养基吗?还有你培养基中加了些什么,一般10%FBS,双抗100单位/ml,谷氨酰胺1%,还有碳酸氢钠.也不知道你是怎么操作的,很难说,能说下你的做细胞过程吗

pailishi

我们是三种酶混合过夜消化呢，效果很好的

nek314

接种细胞有多少呢？换过液么？我觉得原代的时候细胞多一点比较好，首次换液培养时间长一些，换的时候半量或者1/3好一点。

赵贵芳

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5 D# g; ~+ n3 I2 U4 j' x2 \. \* {; O6 s' U. y( m- s6 ?. [! d3 H
请问是哪三种酶啊？

细胞干

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9 r" _- \# f' n3 f  z$ `- T; h& f! P1 W& y. K3 V5 Y
我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS，也是加100U/ml双抗。
$ ^8 w* Z" n% ]6 _# i# Z" I- A我的做法是脐带拔胶后，盲剪剪碎，然后加0.1%二型胶原酶消化4h，这个时候组织比较松散了，然后再直接加0.25%胰酶消化30min，这个时候组织块已经很少了。终止消化，加PBS稀释10~20倍，过滤。
8 B* I- [0 v) M/ f% {/ f消化液梯度离心（2500rpm 15min，1500rpm 15min，800rpm 10min）。2 q& s/ D  ^% e
但是做下来，感觉得到的细胞不多，而且细胞基本都不贴壁，过几天都死了。
8 p2 ?$ n/ U% ~' E; J0 R- O请问你是怎么做的，结果怎么样？' }. u* t5 D6 `- |

细胞干

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. p1 u/ v4 n9 c3 P5 y4 e. X* e是那三种酶啊，消化时间多少啊？请问你消化得到的细胞多吗？几天贴壁？

yingjie

回复 细胞干 的帖子9 y4 f3 A5 }9 h; C6 B" a

7 o/ n1 x, i# c" ?6 | 大部分都差不多，就是在消化上有点不同，这是我的做法
/ y+ V4 u$ n  h
0 W1 O+ O6 o. gWharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的! O( {- c' O. m# k, J9 [4 r
小烧杯中，置于37度恒温培养箱中消化4-6h
% p3 R( S2 j3 F+ J' [$ b! \: q    加入适当体积的PBSA（PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，即BSA），一般是& x8 \1 u) o7 h7 o+ [3 j0 x
胶原酶溶液体积的2倍，250g离心5分钟。
8 f, f  C; [3 {* V7 ?9 P    弃上清液，加入2.5%胰蛋白酶（大约是沉淀物体积的2倍），37度处理30
: K8 p" @: p$ h3 r& t& R. |& w: a' k分钟，轻轻摇动。! `: |5 C3 G; |+ l) A# O/ K/ ]+ o
    加入适当体积的FBS（消化酶体积的10%）中止消化。5 F: Q. m" N+ e' V* V
    1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.  n, a0 d& C0 h, \3 |7 C
    用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少  z- d; x- |# E2 Z
许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在6 f/ ~8 [; @. [: B: g
1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.
* B; T# O3 k/ c: {  ^  ^, M+ y8 o4 y5 w6 S& E; o
     我想，你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心，再加入胰酶消化，还有就是消化完组织后，要清洗细胞，这个很重要，把残留的胰酶清洗掉0 e: p1 `" l$ O5 x

上官冰梦

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  ~. }: z$ ~3 y( x5 W' v# `3 W3 |6 `  e) ?$ M2 q
为什么选择二型胶原酶啊？一型不行吗？我也是刚准备做这个用的是一型

细胞干

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1 y" O; A6 s# t/ l
, q6 @0 K# Z. M* ?, h. q请问yingjie：1.胶原酶消化、离心后，上清会不会分层啊，因为胶原比较粘稠，弃上清是把所有的上清都弃掉吗？会不会损失细胞啊？
# W$ @( B! B8 c) w$ Q6 T2.胰酶消化终止后不要过滤吗？还是先过滤再离心啊？