请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题

细胞干

我用的是0.1%二型胶原酶消化4小时，0.25%胰酶消化30min，但是细胞养几天就死了，请问是不是胰酶消化时间太长，过度消化所致啊？

yingjie

这个说不定的，根据你胰酶和胶原酶浓度和消化时间不应该是消化过度的问题，如果你的消化酶没什么问题的话，就查查你的培养基有没有问题，用的是DMEM/F12培养基吗?还有你培养基中加了些什么,一般10%FBS,双抗100单位/ml,谷氨酰胺1%,还有碳酸氢钠.也不知道你是怎么操作的,很难说,能说下你的做细胞过程吗

pailishi

我们是三种酶混合过夜消化呢，效果很好的

nek314

接种细胞有多少呢？换过液么？我觉得原代的时候细胞多一点比较好，首次换液培养时间长一些，换的时候半量或者1/3好一点。

赵贵芳

回复 pailishi 的帖子4 u0 N/ t; [4 b% l  C$ d8 s# ?

3 C  x9 {3 O7 F; m; i. n4 S请问是哪三种酶啊？

细胞干

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7 ?- ?/ f& |% k! [& x1 Q/ o我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS，也是加100U/ml双抗。
' d) _) j6 K; w+ @4 q, _6 r我的做法是脐带拔胶后，盲剪剪碎，然后加0.1%二型胶原酶消化4h，这个时候组织比较松散了，然后再直接加0.25%胰酶消化30min，这个时候组织块已经很少了。终止消化，加PBS稀释10~20倍，过滤。9 W1 ?# A6 J, z4 a& o  c
消化液梯度离心（2500rpm 15min，1500rpm 15min，800rpm 10min）。
8 o" v( P. h2 O0 K- P, M; I# n但是做下来，感觉得到的细胞不多，而且细胞基本都不贴壁，过几天都死了。
4 g( J9 D: ^& ^. n. Q  H请问你是怎么做的，结果怎么样？
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细胞干

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& U7 s$ m# ~- u/ O8 K1 y是那三种酶啊，消化时间多少啊？请问你消化得到的细胞多吗？几天贴壁？

yingjie

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大部分都差不多，就是在消化上有点不同，这是我的做法
* v- e; I3 C/ `" F+ ^
/ X& R4 n5 _. E$ S& sWharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的
0 m8 p% x* P8 G2 r* f  p小烧杯中，置于37度恒温培养箱中消化4-6h9 Q/ u1 l+ E3 N
    加入适当体积的PBSA（PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，即BSA），一般是
2 O  E9 X' @- P( F, q! M胶原酶溶液体积的2倍，250g离心5分钟。
2 Z9 f, _9 ~* S# J0 ]    弃上清液，加入2.5%胰蛋白酶（大约是沉淀物体积的2倍），37度处理30, {8 Y; _- {$ F" t) |2 O# D- @% s
分钟，轻轻摇动。
' n1 e4 N5 j  u! H  F: o, e* l    加入适当体积的FBS（消化酶体积的10%）中止消化。! a0 e9 S$ Y3 H# ~% d9 ?( _
    1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.
, A( r0 S9 U1 y( |    用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少% N8 o$ u7 x0 S: s4 g! l, p
许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在- p, }) H0 G3 @- Z
1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.' y/ t/ v3 W+ G$ j" S8 r
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     我想，你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心，再加入胰酶消化，还有就是消化完组织后，要清洗细胞，这个很重要，把残留的胰酶清洗掉) P+ P5 \' y& Z% Z& W" Q) t

上官冰梦

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为什么选择二型胶原酶啊？一型不行吗？我也是刚准备做这个用的是一型

细胞干

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. k0 i7 `1 ~" `" {9 o
请问yingjie：1.胶原酶消化、离心后，上清会不会分层啊，因为胶原比较粘稠，弃上清是把所有的上清都弃掉吗？会不会损失细胞啊？
' r, V! h) t4 p) w. K2 @+ U2.胰酶消化终止后不要过滤吗？还是先过滤再离心啊？