请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题

细胞干

我用的是0.1%二型胶原酶消化4小时，0.25%胰酶消化30min，但是细胞养几天就死了，请问是不是胰酶消化时间太长，过度消化所致啊？

yingjie

这个说不定的，根据你胰酶和胶原酶浓度和消化时间不应该是消化过度的问题，如果你的消化酶没什么问题的话，就查查你的培养基有没有问题，用的是DMEM/F12培养基吗?还有你培养基中加了些什么,一般10%FBS,双抗100单位/ml,谷氨酰胺1%,还有碳酸氢钠.也不知道你是怎么操作的,很难说,能说下你的做细胞过程吗

pailishi

我们是三种酶混合过夜消化呢，效果很好的

nek314

接种细胞有多少呢？换过液么？我觉得原代的时候细胞多一点比较好，首次换液培养时间长一些，换的时候半量或者1/3好一点。

赵贵芳

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5 R, R5 t5 `* x6 Z/ M! U% `6 N请问是哪三种酶啊？

细胞干

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) C2 |0 q2 G( n3 D& k- Q. A; X  ^" o' [% X) P2 B" R  w, Q2 N
我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS，也是加100U/ml双抗。
$ G+ S& `& c/ K4 y2 ?我的做法是脐带拔胶后，盲剪剪碎，然后加0.1%二型胶原酶消化4h，这个时候组织比较松散了，然后再直接加0.25%胰酶消化30min，这个时候组织块已经很少了。终止消化，加PBS稀释10~20倍，过滤。/ }+ u. ^; N/ P6 ~6 Q. x
消化液梯度离心（2500rpm 15min，1500rpm 15min，800rpm 10min）。
: S+ H" E0 Y) ?但是做下来，感觉得到的细胞不多，而且细胞基本都不贴壁，过几天都死了。
' M' n. T7 t: _! b9 z请问你是怎么做的，结果怎么样？( O& W  A' G" a3 G

细胞干

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* m' E$ W4 K  ^' ]; v& Q" B6 Q2 S& T! j1 A3 [6 D
是那三种酶啊，消化时间多少啊？请问你消化得到的细胞多吗？几天贴壁？

yingjie

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/ }) t( _3 q$ \0 G5 [* C! d& ]! ?
& I1 e' J  K( ]" ^ 大部分都差不多，就是在消化上有点不同，这是我的做法. p" x$ v! |7 b; V% ]/ s& @, P6 ?
+ y! Z5 n; g% F* j
Wharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的5 K7 ]6 M7 D7 H& G$ l6 R: ^; G0 T
小烧杯中，置于37度恒温培养箱中消化4-6h+ c* ~" O7 e! w6 x7 G0 n
    加入适当体积的PBSA（PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，即BSA），一般是# x) |7 y5 ?2 i0 r) |
胶原酶溶液体积的2倍，250g离心5分钟。
  Z$ q) @( |- d0 K" U    弃上清液，加入2.5%胰蛋白酶（大约是沉淀物体积的2倍），37度处理30. o4 Z; f* M* }" f* ?) X
分钟，轻轻摇动。
0 D+ y, R! o9 B9 B2 j6 s: ^: u    加入适当体积的FBS（消化酶体积的10%）中止消化。
' g  @  {- @* S( s! F5 ~    1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.
5 q' ~& x: {6 r1 b: f9 d" y    用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少
1 [0 y1 ]8 K) \7 a- r' M2 ]许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在$ O0 `& F+ Q0 F3 ]; V7 A
1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.6 u3 H& Y) f7 K! S
9 t4 c4 v2 p2 e' T: W- p8 o
     我想，你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心，再加入胰酶消化，还有就是消化完组织后，要清洗细胞，这个很重要，把残留的胰酶清洗掉4 V0 @3 D8 B6 V: [6 n

上官冰梦

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5 U  T/ I0 J( O1 |为什么选择二型胶原酶啊？一型不行吗？我也是刚准备做这个用的是一型

细胞干

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" L% ~6 k7 ~6 J5 p
请问yingjie：1.胶原酶消化、离心后，上清会不会分层啊，因为胶原比较粘稠，弃上清是把所有的上清都弃掉吗？会不会损失细胞啊？
) N2 a; o% h* {1 F: k: ?% ]+ O2.胰酶消化终止后不要过滤吗？还是先过滤再离心啊？