请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题

细胞干

我用的是0.1%二型胶原酶消化4小时，0.25%胰酶消化30min，但是细胞养几天就死了，请问是不是胰酶消化时间太长，过度消化所致啊？

yingjie

这个说不定的，根据你胰酶和胶原酶浓度和消化时间不应该是消化过度的问题，如果你的消化酶没什么问题的话，就查查你的培养基有没有问题，用的是DMEM/F12培养基吗?还有你培养基中加了些什么,一般10%FBS,双抗100单位/ml,谷氨酰胺1%,还有碳酸氢钠.也不知道你是怎么操作的,很难说,能说下你的做细胞过程吗

pailishi

我们是三种酶混合过夜消化呢，效果很好的

nek314

接种细胞有多少呢？换过液么？我觉得原代的时候细胞多一点比较好，首次换液培养时间长一些，换的时候半量或者1/3好一点。

赵贵芳

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3 y% K; f! z8 A- S9 w- H- S5 I1 A! u- j: j. n" c9 }. d, t
请问是哪三种酶啊？

细胞干

回复 yingjie 的帖子3 L3 w. ~1 d- z' h

7 n$ C1 u+ v; N# z我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS，也是加100U/ml双抗。
: z; Y! ~" q( N+ [. C我的做法是脐带拔胶后，盲剪剪碎，然后加0.1%二型胶原酶消化4h，这个时候组织比较松散了，然后再直接加0.25%胰酶消化30min，这个时候组织块已经很少了。终止消化，加PBS稀释10~20倍，过滤。$ d; g" ^  w. ~8 C' D
消化液梯度离心（2500rpm 15min，1500rpm 15min，800rpm 10min）。
7 y5 r  f# X+ ]但是做下来，感觉得到的细胞不多，而且细胞基本都不贴壁，过几天都死了。4 F3 }; ?& x2 y- T& s( e
请问你是怎么做的，结果怎么样？9 T8 O% I# _5 L) m# d5 k$ E4 Y  E& D: f

细胞干

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7 G( Z: Z# h6 D# @3 Q4 V2 O
$ }/ _6 ]. s" s3 T$ t3 A是那三种酶啊，消化时间多少啊？请问你消化得到的细胞多吗？几天贴壁？

yingjie

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- L9 F. _, t5 K0 T
9 G& K, W7 @$ ~+ c% ]3 ^ 大部分都差不多，就是在消化上有点不同，这是我的做法
, {" b+ k* w, @8 w( G& k( s
7 ]( j. ]' I  L* O4 E; z7 q9 O# vWharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的: x1 m& Q2 ~; m* ?
小烧杯中，置于37度恒温培养箱中消化4-6h  J0 G5 i% W6 }  x  W% k/ l0 `9 G+ m
    加入适当体积的PBSA（PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，即BSA），一般是
3 e  s' Z& Y6 {3 e胶原酶溶液体积的2倍，250g离心5分钟。4 M1 C: A* P3 `% z
    弃上清液，加入2.5%胰蛋白酶（大约是沉淀物体积的2倍），37度处理30
  V4 _- n# ^* S1 g" B/ O分钟，轻轻摇动。
3 {: f* [5 V$ d! B+ H+ U" o5 |    加入适当体积的FBS（消化酶体积的10%）中止消化。
' {0 a& V0 @1 W, z    1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.
) Z7 i4 P: o( N3 Y  [    用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少
4 j* y+ E; ^8 O6 |' g. L许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在
# @6 f4 v1 E' c$ |0 `! [7 G1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.
; F" e6 Y# G. S! d" V0 D/ g2 B8 }0 o1 ~/ S, \0 c
     我想，你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心，再加入胰酶消化，还有就是消化完组织后，要清洗细胞，这个很重要，把残留的胰酶清洗掉
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上官冰梦

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1 k: ?; A' C8 o9 F9 P
; J; y" ]; E8 g- p$ W为什么选择二型胶原酶啊？一型不行吗？我也是刚准备做这个用的是一型

细胞干

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& [6 U  E7 u4 B  c  S) ^/ c+ j  H9 e请问yingjie：1.胶原酶消化、离心后，上清会不会分层啊，因为胶原比较粘稠，弃上清是把所有的上清都弃掉吗？会不会损失细胞啊？
3 K3 l& y  k" X' K7 j* S& a2.胰酶消化终止后不要过滤吗？还是先过滤再离心啊？