请教酶消化法培养脐带间充质干细胞的问题

细胞干

我用的是0.1%二型胶原酶消化4小时，0.25%胰酶消化30min，但是细胞养几天就死了，请问是不是胰酶消化时间太长，过度消化所致啊？

yingjie

这个说不定的，根据你胰酶和胶原酶浓度和消化时间不应该是消化过度的问题，如果你的消化酶没什么问题的话，就查查你的培养基有没有问题，用的是DMEM/F12培养基吗?还有你培养基中加了些什么,一般10%FBS,双抗100单位/ml,谷氨酰胺1%,还有碳酸氢钠.也不知道你是怎么操作的,很难说,能说下你的做细胞过程吗

pailishi

我们是三种酶混合过夜消化呢，效果很好的

nek314

接种细胞有多少呢？换过液么？我觉得原代的时候细胞多一点比较好，首次换液培养时间长一些，换的时候半量或者1/3好一点。

赵贵芳

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9 w6 v5 H5 x: u/ f+ i5 v) E
# \  f7 F1 U! v* f请问是哪三种酶啊？

细胞干

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2 J' n8 v" T' ?; D, P3 U
: G( T- R1 z: z, E我用的是GIBICO的DMEM培养基和FBS，也是加100U/ml双抗。9 a( o; \5 w/ q
我的做法是脐带拔胶后，盲剪剪碎，然后加0.1%二型胶原酶消化4h，这个时候组织比较松散了，然后再直接加0.25%胰酶消化30min，这个时候组织块已经很少了。终止消化，加PBS稀释10~20倍，过滤。- \4 X/ n8 O, o4 s
消化液梯度离心（2500rpm 15min，1500rpm 15min，800rpm 10min）。+ i" c9 J1 T3 s$ D8 [3 G5 W
但是做下来，感觉得到的细胞不多，而且细胞基本都不贴壁，过几天都死了。) p3 h$ t7 j+ d1 T( L  z0 g4 K5 l
请问你是怎么做的，结果怎么样？; [% L6 h- f( x5 g' t& f- E

细胞干

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) W. U/ l2 a3 o是那三种酶啊，消化时间多少啊？请问你消化得到的细胞多吗？几天贴壁？

yingjie

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4 u) r' b: I9 s9 [' [, d
, s$ ~1 C, b! M 大部分都差不多，就是在消化上有点不同，这是我的做法
+ c4 M; \7 W* k+ T( B$ N
9 v; h0 z1 t7 @! A) gWharton胶组织用剪刀剪成1mm3的碎块于是先准备好的装有0.1%胶原酶的/ k7 U; u9 g; U7 C6 I; Q/ R
小烧杯中，置于37度恒温培养箱中消化4-6h
$ d. Y0 T  G& D( l) Y    加入适当体积的PBSA（PBS缓冲液中加入牛血清白蛋白，即BSA），一般是- V; _5 l# o0 R4 @6 q
胶原酶溶液体积的2倍，250g离心5分钟。$ q8 H' n8 t& @8 g2 S' H
    弃上清液，加入2.5%胰蛋白酶（大约是沉淀物体积的2倍），37度处理30  h" R3 S% L! T' C" P! ^
分钟，轻轻摇动。5 {: k5 \. t+ q
    加入适当体积的FBS（消化酶体积的10%）中止消化。
/ t* B* X1 M( _: \3 X    1200r/min离心5分钟,弃上清,用PBS清洗2次.
8 f# r" ^- \: O1 B/ g, v) @* }# D    用培养液重悬分离得到的细胞,用滴管吸取细胞悬液于培养瓶中,摇匀.取少, @9 I; Z' \$ H
许于细胞计数板,生物显微镜下观察计数,加入培养液,调整细胞悬液浓度大约在
9 r9 Y9 h8 E+ k* s, n1*10 6/ml.置于37度,5%CO2的饱和湿度培养箱中培养.
3 u! Q  E; }* e$ M1 u; W8 I" a1 I% K- [! U/ r6 x5 W+ v$ [
     我想，你在消化上应该在胶原酶消化完了之后最好先终止消化离心，再加入胰酶消化，还有就是消化完组织后，要清洗细胞，这个很重要，把残留的胰酶清洗掉
0 N" b5 V( K" d/ ^$ v

上官冰梦

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) t; t: G8 \9 h0 @; \
为什么选择二型胶原酶啊？一型不行吗？我也是刚准备做这个用的是一型

细胞干

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) w. z, z( _7 ]: Z' h
) M" `* c9 x/ R2 V1 n请问yingjie：1.胶原酶消化、离心后，上清会不会分层啊，因为胶原比较粘稠，弃上清是把所有的上清都弃掉吗？会不会损失细胞啊？
+ P$ s% \7 m8 _5 f  `2.胰酶消化终止后不要过滤吗？还是先过滤再离心啊？