Western细胞裂解液的裂解效果与蛋白保存问题

runsong

我们做western使用的裂解液主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，冰上将细胞吹散并裂解30分钟，之后12000转离心并弃上清，-20度保存。但此蛋白样品在保存过程中会有絮状物生成，严重影响蛋白浓度测定与使用。不知大家有没有遇到过此类情况，是何原因，如何解决？

zxcv12345

回复 runsong 的帖子0 L8 n6 u; W7 B4 d) U

2 j" {& z8 M8 D蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。/ w9 o: V9 ~5 b, m. T
$ r, U7 ]2 a9 _; ?& f! h
在冻存前，可降低浓度。
6 ], _# C" D* p) M/ j" ~- H0 _如果不容易降解，可考虑4度保存

zxcv12345

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: v+ _* c) W1 A
% v& x: L- o& \7 S蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。# \; t/ _: T) D% i2 g
3 m4 i3 n0 c) O. K/ T
在冻存前，可降低浓度。
, r2 s3 ~; h' `1 q$ I* U: Y如果不容易降解，可考虑4度保存

runsong

回复 zxcv12345 的帖子; j% r& Y2 H( Y- _+ q8 O& h/ S
! q4 i- F$ t% v
谢谢。还有几个问题。2 _7 G1 Z& G2 s9 a. s
1、你们用的浓度大概多高啊，我一般是大约20微克每微升？2 _6 M5 d: k& e/ `& f! O
2、形成沉淀与残留的DNA有无关系？
* h% {1 i: d! j8 \3、我所用的裂解液有改进的必要吗？" u; w* I7 F' a: p% a

zzzhouzhong

我们实验室比较懒，做western直接PBS重悬细胞后加4*sds loading buffer煮，然后离心上样。做IP啥的才裂解，给你我们的配方。。NP40裂解液: 1M Tris8.0储液10ml，2M NaCl 15ml，NP40   2ml，dd水 173ml，配好后取50ml，加1片蛋白酶抑制剂PNSF，溶解后分装1200ul每管，-20保存。另外我们蛋白样品一般放-80，不过貌似跟这没有关系

zxcv12345

回复 runsong 的帖子9 f0 S: _5 Q3 k

. u* b( P2 |; X' h  S) l4 l* e1.一般浓度一般低于5ug/ul，最多不会超过10ug/ul7 x- Q7 Q. u& k) o! W/ l
2。对不起，与DNA关系不清楚，但离心后大部分的DNA都沉下了，应影响不大
8 j& q( @* T  y  i' V3.裂解液的问题应该不大

sykbod

回复 runsong 的帖子3 r& N9 Y7 c6 |1 o9 k2 E. }
5 v' @0 G) y9 U
1.       5 ug/ uL. Higher conc. leads to deposits. ( U9 `, H$ J( ~& k! p4 x
2.       Genome DNA looks like white flocculent deposits. But not your case I think.0 @; d. A: J: V+ K
3.       Depend on which pr you want to harvest. Membrane pr? ribonucleoprotein? ...
% h3 |( ~5 u0 A6 z& U0 {          generally, your lysis buffer should be good.1 q, H8 Q( S' i, o4 Q/ ?1 ?; t

cjian6352

可以在保存前测浓度，然后加loading buffer煮了再保存，这样蛋白更稳定，不易降解，对后续实验也方便

biotly

回复 zzzhouzhong 的帖子6 H; m( @: a& y6 W# K: Q( A
/ Y% N* s0 ?: ^; ?5 b7 O9 w
这样子可以做出来吗？条带好不好看啊~~很期待

YYQ6301

我们两种处理方法，一个是离心去沉淀，一个是煮好后保存