Western细胞裂解液的裂解效果与蛋白保存问题

runsong

我们做western使用的裂解液主要成分为20mM Tris(pH7.5)，150mM NaCl，1% Triton X-100，冰上将细胞吹散并裂解30分钟，之后12000转离心并弃上清，-20度保存。但此蛋白样品在保存过程中会有絮状物生成，严重影响蛋白浓度测定与使用。不知大家有没有遇到过此类情况，是何原因，如何解决？

zxcv12345

回复 runsong 的帖子
% O, L! K0 V) L, L" u4 {- ]
4 q% }) j, [3 J2 n- U蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。
2 y7 A' D4 A! R4 d' I# c7 K* R( F. N% f" q/ x" X3 M4 R
在冻存前，可降低浓度。
0 B) g$ v3 x' Q. ]1 R! L- b; c$ _如果不容易降解，可考虑4度保存

zxcv12345

回复 runsong 的帖子) ~  w: b4 K% }# M9 B
8 A& f" U2 P: i$ ?; |2 _) E. {8 [& k1 I
蛋白浓度高，或容易变性，可出现沉淀，有的为絮状。。解冻后，应离心，弃出沉淀然后测定蛋白浓度及使用。
+ X/ c8 v! [/ @" ?* ~6 b( d! A
7 j2 O" d5 ]! K( L5 b在冻存前，可降低浓度。
/ U  h% a& Q4 T( }如果不容易降解，可考虑4度保存

runsong

回复 zxcv12345 的帖子1 z& r) O4 v; {# N1 D0 ?
* [: {6 Z0 |4 t- S4 c1 g2 e) W
谢谢。还有几个问题。4 s; w  ?& i/ g% W3 d8 K4 L
1、你们用的浓度大概多高啊，我一般是大约20微克每微升？
$ W- L* |1 k$ O2 N2、形成沉淀与残留的DNA有无关系？
* W/ }8 ]$ X+ m; O3、我所用的裂解液有改进的必要吗？
% V' C7 v% H* L

zzzhouzhong

我们实验室比较懒，做western直接PBS重悬细胞后加4*sds loading buffer煮，然后离心上样。做IP啥的才裂解，给你我们的配方。。NP40裂解液: 1M Tris8.0储液10ml，2M NaCl 15ml，NP40   2ml，dd水 173ml，配好后取50ml，加1片蛋白酶抑制剂PNSF，溶解后分装1200ul每管，-20保存。另外我们蛋白样品一般放-80，不过貌似跟这没有关系

zxcv12345

回复 runsong 的帖子( q5 T/ f# [. o

1 g, [  @; g  q" A1.一般浓度一般低于5ug/ul，最多不会超过10ug/ul
( b  H6 O4 f' e% b* k2。对不起，与DNA关系不清楚，但离心后大部分的DNA都沉下了，应影响不大6 \& k, x- m+ @. w
3.裂解液的问题应该不大

sykbod

回复 runsong 的帖子% l9 c7 ^# x8 q4 q2 ]

3 i) I, X" X1 F1 I1.       5 ug/ uL. Higher conc. leads to deposits.   s' n7 q% \1 p7 R4 h& r; O
2.       Genome DNA looks like white flocculent deposits. But not your case I think.& ?0 ]0 n! o0 t. j1 ^- l
3.       Depend on which pr you want to harvest. Membrane pr? ribonucleoprotein? ...+ [0 J2 r4 h" d) c( T
          generally, your lysis buffer should be good.
7 p" v1 N* M1 [; P  h1 t, t

cjian6352

可以在保存前测浓度，然后加loading buffer煮了再保存，这样蛋白更稳定，不易降解，对后续实验也方便

biotly

回复 zzzhouzhong 的帖子
/ S" i+ X" P+ ~. x# o, L" K+ |9 A' P2 V% `8 F
这样子可以做出来吗？条带好不好看啊~~很期待

YYQ6301

我们两种处理方法，一个是离心去沉淀，一个是煮好后保存