PCR搞不定了，丢脸啊～请各位高人指教！

hndxws

既然你要试，那你就试吧，长点经验也好。

ying

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非常感谢！另外感谢楼上诸位！我想我先按照楼上试试，搞不定再换引物吧～毕竟订引物比较麻烦，手边能作的努力先试试。

ying

我是从质粒P，不是从基因组。要克隆到另一个载体上的。位置都定好了不能换的，引物只能这样，引物就是最两端的序列。没法换引物，只能改变其长度。我的引物其CG比例都正常的。

hndxws

上面几楼回复的都有道理，但是我个人觉得都不是出现这问题的重点，如果不信楼主可以按他们的建议试试，看是否会有改进。我觉得进你目前提供的信息，最可能出现问题的是你的引物。
; z% X+ C0 G6 ~+ |9 g5 L# {8 o( e( hPCR反应，如果实际都是好用的话，主要的就是模板和引物。在你这里主要是引物出问题了。具体来说是你forward的引物退火温度太低，我用软件看了一下，只有40度多一点，这样的引物在你的条件下是不太可能有条带的，而reverse引物的退火温度就可以。所以你的问题是引物不合适导致退火温度不合适，PCR不能有条带。7 b& _! I. `$ k( i! U3 b4 q7 G
我们很多同仁，都觉得PCR简单，但是真正对PCR条件有理解的却在少数，大家都是嚷着，引物长度多少到多少，退火温度什么加减5度，太机械，我从来没有按什么加减5度做实验。最主要的就是引物实际的退火温度。在你的引物里，第一个长度虽有26，但是退火温度还没达到你设定的条件，第二个虽然24但是已经达到你的退火条件，PCR退火条件同时也不能设太低，低于43度的话，会因自由能低，一样不成功。
; K- `/ e! Y# p我的建议是把你的第一条引物换掉，在原有的基础上再加5个碱基，即attgattattgactagttattaatagtaatc，把退火温度设到55，一般的质粒模板，这个条件绝对没问题。你试试，希望把结果告诉大家。

zxcv12345

回复 ying 的帖子/ t! p/ E5 x$ Z! X# k, L( t
, O7 x7 _3 g/ \
很正常的。
" D& A, b" V: G* x' a5 B# ]4 p3 E; r# b) \( }% J4 s/ e+ Y
promoter的GC含量高。DMSO条件可达20%。
2 N6 Q  x9 p- n7 M) J0 z# o; {. r4 }. C% q& J3 e9 M6 E2 P
Takara也有专门针对高GC的试剂盒, 用起来还可以。
( Q5 U) O2 \4 z( T
( m6 O8 U: e  }8 o4 H1 Q另外，一定要确定质粒没问题。去年我PCR扩增质粒，做了一个月，什么条件都試了，最后测序发现对方给的质粒错了，

sykbod

手边没软件就没对你的引物，想来做了那么多引物应该没问题。
1 _: d! V$ S0 E, X) H& b一般这种情况我加DMSO了 退火时间给1min
8 o0 t( A. l: Q. x* c2 j- a局部超过90%应该也会有条带不会很干净，除非你两个引物刚开始p就进入高CG区。不加DMSO的话曾经做出来过72度退火才有条带的（两步法很好用 真的）。加了之后减5-10度都可以。具体看模板了。
: v* _! |' k/ E' j2 d% M# B话说做一个梯度不就完事了