PCR搞不定了，丢脸啊～请各位高人指教！

ying

这货叫做CAG promoter，俺是以质粒为模板P的，确定质粒是好的。序列如下：
8 i1 q, z3 Q. q( Dattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcgtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcgggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtgcggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctggcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcgggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccatctccagcctcggggctgccgcagggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaa' o7 w4 [3 z" `2 I9 _
引物：0 J" K/ Y+ z5 h6 ?) @3 y- x
F：attgattattgactagttattaatag9 [; ~4 D( `. G5 |
R：tttgccaaaatgatgagacagcac
' O& x/ p$ b- _3 o; e: {6 W4 ZKOD-Plus的标准反应体系。56度和68度退火都试过。干干净净没任何带，只有前沿有个引物的影子。平行P的别的样品都是好的，说明体系本身东西都是好用的。
% L6 S! t- }" B7 o& M我强烈怀疑是由于CG太高导致的。虽然总体CG只有66%，但局部有些超过了90%。我对P高CG没有经验。据说是加DMSO，或者提高Mg，或者提高退火温度or解链时间，或者用一个叫slow down的特殊方法。总之“或者”太多而我的精力太少。鄙人这辈子做的克隆没有200个也有100多个了，没想到居然今天连个质粒上的序列都P不下来。暂时懒得摸条件了，借用宝地问问高手。
- v" t/ d9 @) s5 W  P. V# i. E* {0 U" {

sykbod

手边没软件就没对你的引物，想来做了那么多引物应该没问题。
8 q: G6 C$ [* X一般这种情况我加DMSO了 退火时间给1min
( T" d8 m' W5 b局部超过90%应该也会有条带不会很干净，除非你两个引物刚开始p就进入高CG区。不加DMSO的话曾经做出来过72度退火才有条带的（两步法很好用 真的）。加了之后减5-10度都可以。具体看模板了。
  P$ j, @0 E+ k/ _3 i6 P8 F; t( P话说做一个梯度不就完事了

zxcv12345

回复 ying 的帖子6 z* B- R* I. J6 s6 J0 D' r
+ p( r: G" t8 R/ Q$ A
很正常的。
2 j6 ^' Z, {0 A) i1 s8 ~
& w0 x+ }9 Y( h: ^% K3 E  p0 f0 S* Jpromoter的GC含量高。DMSO条件可达20%。
# ]! ^5 c! c* q2 d6 `& A3 S1 S& {. B$ s4 i6 l( S# ?
Takara也有专门针对高GC的试剂盒, 用起来还可以。
4 }/ F& S& k  k" B* r, w, w3 o( j* q0 p
另外，一定要确定质粒没问题。去年我PCR扩增质粒，做了一个月，什么条件都試了，最后测序发现对方给的质粒错了，

hndxws

上面几楼回复的都有道理，但是我个人觉得都不是出现这问题的重点，如果不信楼主可以按他们的建议试试，看是否会有改进。我觉得进你目前提供的信息，最可能出现问题的是你的引物。; O3 U8 E% R4 w& ^0 T4 r5 k6 \
PCR反应，如果实际都是好用的话，主要的就是模板和引物。在你这里主要是引物出问题了。具体来说是你forward的引物退火温度太低，我用软件看了一下，只有40度多一点，这样的引物在你的条件下是不太可能有条带的，而reverse引物的退火温度就可以。所以你的问题是引物不合适导致退火温度不合适，PCR不能有条带。
6 T( Y" b  @& U! P8 g+ g# Q( ~: ^- I, b我们很多同仁，都觉得PCR简单，但是真正对PCR条件有理解的却在少数，大家都是嚷着，引物长度多少到多少，退火温度什么加减5度，太机械，我从来没有按什么加减5度做实验。最主要的就是引物实际的退火温度。在你的引物里，第一个长度虽有26，但是退火温度还没达到你设定的条件，第二个虽然24但是已经达到你的退火条件，PCR退火条件同时也不能设太低，低于43度的话，会因自由能低，一样不成功。: w# C- c3 e" i7 y
我的建议是把你的第一条引物换掉，在原有的基础上再加5个碱基，即attgattattgactagttattaatagtaatc，把退火温度设到55，一般的质粒模板，这个条件绝对没问题。你试试，希望把结果告诉大家。

ying

我是从质粒P，不是从基因组。要克隆到另一个载体上的。位置都定好了不能换的，引物只能这样，引物就是最两端的序列。没法换引物，只能改变其长度。我的引物其CG比例都正常的。

ying

回复 hndxws 的帖子; ?- J6 W0 q7 ^% S$ `; v0 x

9 |# H$ m, A6 k# I5 A非常感谢！另外感谢楼上诸位！我想我先按照楼上试试，搞不定再换引物吧～毕竟订引物比较麻烦，手边能作的努力先试试。

hndxws

既然你要试，那你就试吧，长点经验也好。

sj03572001

建议用TAKARA 的PrimeSTAR® HS DNA Polymerase with GC Buffer，货号：：DR044A，我去年扩一个基因遇到高GC的情况，普通的TAQ酶总是跳过高GC区（高GC区可以形成复杂的二级结构），或者在高GC区延伸终止，后来用TAKARA的这个酶，一次就搞定了

ying

回复 hndxws 的帖子
4 w6 Z, F' [1 m# G% Y  p6 O; c& N! M. C. W2 S5 ?
多谢这位大神，至少现在我自己看来，可能此大神的话真的是对的。鄙人教训果然长了不少我摸了DMSO梯度，退火温度梯度，Mg梯度，还换了个invitrogen的高CG酶，果然都不行。条带我就不献丑了。我马上订引物，做完再向大家汇报！

ying

回复 sj03572001 的帖子, F% p  ^" c; S; M, H  p4 Z  @
, g# _) Z* S' ?; V7 ^
此酶我们实验室还真有，可惜找遍冰箱，酶确实找到了，还不少，就是没有buffer。汗～