PCR搞不定了，丢脸啊～请各位高人指教！

ying

这货叫做CAG promoter，俺是以质粒为模板P的，确定质粒是好的。序列如下：
1 ]+ X5 x0 d8 z# R3 p' Sattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggactatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatgggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggctcgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttaaagggctccgggagggccctttgtgcgggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggcccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcgtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcgggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcggcggtcgggctgtaacccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtgcggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctggcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagcgggcgcgggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccatctccagcctcggggctgccgcagggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaa
; j+ p& k' ?7 m2 w6 Q- u引物：
+ }: B4 d! r  x) c( t4 i, w* _F：attgattattgactagttattaatag
/ S2 X5 g& u% r5 n; o% MR：tttgccaaaatgatgagacagcac9 E1 C  d( C0 G" O% g7 A' y/ N2 e
KOD-Plus的标准反应体系。56度和68度退火都试过。干干净净没任何带，只有前沿有个引物的影子。平行P的别的样品都是好的，说明体系本身东西都是好用的。
* O' h9 q4 z$ H4 J我强烈怀疑是由于CG太高导致的。虽然总体CG只有66%，但局部有些超过了90%。我对P高CG没有经验。据说是加DMSO，或者提高Mg，或者提高退火温度or解链时间，或者用一个叫slow down的特殊方法。总之“或者”太多而我的精力太少。鄙人这辈子做的克隆没有200个也有100多个了，没想到居然今天连个质粒上的序列都P不下来。暂时懒得摸条件了，借用宝地问问高手。
+ k, S  H: o& E& Q7 @$ S

sykbod

手边没软件就没对你的引物，想来做了那么多引物应该没问题。
! H! i) R* V. c* G: t* g9 U' n6 p一般这种情况我加DMSO了 退火时间给1min4 r  z4 f, R* q& d, N
局部超过90%应该也会有条带不会很干净，除非你两个引物刚开始p就进入高CG区。不加DMSO的话曾经做出来过72度退火才有条带的（两步法很好用 真的）。加了之后减5-10度都可以。具体看模板了。
& U6 x# E' R+ S# n0 ~% Q话说做一个梯度不就完事了

zxcv12345

回复 ying 的帖子$ V4 z) j" V, l$ a$ z7 [6 f# _

$ P! o: z5 s: b! ]9 ?6 v9 Y+ \0 T3 J很正常的。
/ y1 I! t5 i3 _# T) t0 v7 Q( V) k# _( z
promoter的GC含量高。DMSO条件可达20%。6 h6 o6 W: r* M8 N) g! j

- D+ e1 v* P" B, @* |Takara也有专门针对高GC的试剂盒, 用起来还可以。
: r( Z. M- \# Y% [; O- {. A& Z7 D$ i1 j
另外，一定要确定质粒没问题。去年我PCR扩增质粒，做了一个月，什么条件都試了，最后测序发现对方给的质粒错了，

hndxws

上面几楼回复的都有道理，但是我个人觉得都不是出现这问题的重点，如果不信楼主可以按他们的建议试试，看是否会有改进。我觉得进你目前提供的信息，最可能出现问题的是你的引物。
/ e" T" Z5 A' \5 T7 |7 RPCR反应，如果实际都是好用的话，主要的就是模板和引物。在你这里主要是引物出问题了。具体来说是你forward的引物退火温度太低，我用软件看了一下，只有40度多一点，这样的引物在你的条件下是不太可能有条带的，而reverse引物的退火温度就可以。所以你的问题是引物不合适导致退火温度不合适，PCR不能有条带。# ^: z* q3 v+ L, W
我们很多同仁，都觉得PCR简单，但是真正对PCR条件有理解的却在少数，大家都是嚷着，引物长度多少到多少，退火温度什么加减5度，太机械，我从来没有按什么加减5度做实验。最主要的就是引物实际的退火温度。在你的引物里，第一个长度虽有26，但是退火温度还没达到你设定的条件，第二个虽然24但是已经达到你的退火条件，PCR退火条件同时也不能设太低，低于43度的话，会因自由能低，一样不成功。
% A: ?+ f" k0 ]我的建议是把你的第一条引物换掉，在原有的基础上再加5个碱基，即attgattattgactagttattaatagtaatc，把退火温度设到55，一般的质粒模板，这个条件绝对没问题。你试试，希望把结果告诉大家。

ying

我是从质粒P，不是从基因组。要克隆到另一个载体上的。位置都定好了不能换的，引物只能这样，引物就是最两端的序列。没法换引物，只能改变其长度。我的引物其CG比例都正常的。

ying

回复 hndxws 的帖子& f8 Z: Q! g: _3 A2 I; w+ A

" a7 ?3 Y" w! j! O! d非常感谢！另外感谢楼上诸位！我想我先按照楼上试试，搞不定再换引物吧～毕竟订引物比较麻烦，手边能作的努力先试试。

hndxws

既然你要试，那你就试吧，长点经验也好。

sj03572001

建议用TAKARA 的PrimeSTAR® HS DNA Polymerase with GC Buffer，货号：：DR044A，我去年扩一个基因遇到高GC的情况，普通的TAQ酶总是跳过高GC区（高GC区可以形成复杂的二级结构），或者在高GC区延伸终止，后来用TAKARA的这个酶，一次就搞定了

ying

回复 hndxws 的帖子
0 o$ n( u- o! u5 s/ e3 H5 W/ F0 N/ m0 R+ l7 r3 e1 T6 ~
多谢这位大神，至少现在我自己看来，可能此大神的话真的是对的。鄙人教训果然长了不少我摸了DMSO梯度，退火温度梯度，Mg梯度，还换了个invitrogen的高CG酶，果然都不行。条带我就不献丑了。我马上订引物，做完再向大家汇报！

ying

回复 sj03572001 的帖子6 L" @5 [1 |% k, U5 s' ^9 s

5 ?8 i* R+ o" |  Q% o" y此酶我们实验室还真有，可惜找遍冰箱，酶确实找到了，还不少，就是没有buffer。汗～