养细胞的一些疑问

huangcong1988

养了小半年细胞，对于细胞培养现在越来越多的疑惑7 k* E" u6 {# X- c. k+ Y) L, a  c
1，细胞培养箱的温度跟二氧化碳浓度对于成纤维细胞或者其它类型细胞影响很大么？（比如，一个下午二氧化碳浓度都没达到4%，或者细胞培养箱门被人打开了一下午，忘了关）
3 e4 h0 t$ v1 P2 b1 K2 |/ D, t5 E2，血清，血清对于细胞培养影响时很大的，具体有哪些呢？（我之前细胞复苏的时候，细胞贴壁，但是越长细胞越脱落，这个是血清原因么？如果是血清问题，细胞应该不会贴壁才对吧？）
; Q. H# C: Y/ x5 p/ n5 {+ f! w' e3，培养箱湿度对于细胞培养影响大么？（我们之前细胞培养箱底一般都倒一些水，然后加些许无水硫酸铜，现在不加硫酸铜了，只加水感觉培养箱里面湿气很大，很闷热），细胞现在长得很慢，而且也是很多脱落的1 i/ q: U- h3 ?3 j8 _7 `
4，细胞瓶里面的圆的，光亮的细胞是死细胞么？现在细胞瓶里很多这种细胞，有的人说这是正生长快贴壁的小细胞，个人估计是死的脱落的细胞，每次换液都会洗一下，但是洗了后还是有这样的一些细胞，不知道这是怎么回事1 e+ L* ?2 g8 P3 v, t* A" A
5，血清，还有KSO等等这些的，在拿进细胞室需要用紫外照么？不照的话感觉不能消毒，可能会带进污染源，照的话，血清中蛋白又可能变性，肿么办？7 o, l- G4 n/ X( A* ^( K' O
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补充内容 (2012-4-23 09:48):6 R4 {  t* L: T
补充一点：换DMEM，对于细胞有影响么？都是高糖的，不过一个是国产的，一个是hyclone的

myrudy

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! [6 o4 W, i4 S/ _9 l' ?
6 Y7 s6 l( e: o! C" P" K' g放心吧 我们一直这么做的 从来没有污染过

pjlsyz

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' u* O( _1 Q$ ?) Y" M) c# o% n2 Z! s" q( `7 O8 d5 O
这样会不会容易污染。。？

细胞海洋

回复 nankou2008 的帖子3 z: P& w  k+ f  L
6 N5 Y. H, [& z! s/ e  w! {
论坛搜索关键词 黑胶虫

nankou2008

很多小黑点是血清的问题吗？有没有人探究过那个小黑点是什么东西？
( {% U5 ^9 X/ w" q& N我们做的也有很多小黑点  一直不知道是什么问题的

流泪的鱼

我认为你的实验细节很重要，下面的细节你注意到了吗？9 R& @' z  V9 \4 j! `
         血清的处理 / E1 l4 [7 Q9 X# h2 ?: L1 m
　　市场上出售的血清一般做了灭菌处理，但在使用前还应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体(近来也有观点认为热灭活处理是不必要的)。      . |3 H' d+ M7 x+ `& R6 N0 b7 e
        胎牛血清不必灭活。
% S7 U: Q1 H% I0 \　　1、 将血清加热至56℃并保持30 min，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。
" W! s% u1 z! `* |: R　　2、 处理后的血清贮存于4℃。
5 X/ ]% ~* p3 }( b3 `2 a+ L　　3、血清在使用前最好进行筛选以掌握血清的质量。
: i( K# c# ~7 ~, i$ L      玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1)高压蒸汽灭菌15分钟以上;2)干烤消毒140度2小时以上;
: h7 x$ ?) h& @: I1 \  b% _      无菌工作台先清洗后用75%酒精擦拭干净，紫外线照射40分钟以上;各种培养板照射3小时以上; 5 e: C/ z, D" j. a
      培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验:将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4度保存;
% m; K- X2 Z# u7 L  }7 X      消化液(pH7.8)或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20度保存;
+ w$ I: B( X* P( V( K5 l0 S; Y      培养箱应先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍(如有紫外线的应照射1小时以上，如有高温灭菌的应按程序来菌)。至少每月一次。% g" G& S' D6 J; I
      生长培养基的配制
/ V: h* n+ `  D( ]7 R8 \" u　　除无血清培养之外，各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。+ h! ]* z" P! j; g2 n( b
      培养基分装成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞紧瓶口。 8 S+ _% d9 _3 c% ~! j
       按如下比例配制： 基本培养基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。 按1％体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U／mL。 * _. {  D/ {9 |* f/ z

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huangcong1988

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0 S% q3 R) {1 d% ]% X6 Z8 O9 z. ^3 f8 B
谢谢

大少爷

要100%湿度。培养箱底用大口不锈钢托盘加水，定期更换，一般每周更换。如果不是100%湿度，培养基中水分会挥发，培养基会变稠，离子浓度大，变成高渗溶液，细胞会死！
% Z* [: L& b, W2 G+ h; m+ v这一点 我学习了

Demon_CN

回复 huangcong1988 的帖子0 _  M9 i$ B6 O% i

" C: l  O, I# n+ w1 a, O! Z首先，你要从冻存入手，看看你冻存液是否正确，我们一般用10%DMSO+培养基冻存细胞1 R) |6 T7 j1 o, Y$ t
然后，看你的冻存过程，有用程序降温盒，隔天再如液氮罐么？
- o* k& g/ ]; E8 h3 g最后，看你的复苏实验，复苏要快速解冻，37℃1min解冻。时间不要拖太长，* |) a) z% p# J4 [/ J0 I$ J
复苏要多洗几遍。  J2 ]1 P5 D: A
要梳理一下你的实验流程中的关键点。

myrudy

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$ c: c- _: a) [4 u: }
6 V/ \5 r) X* S' T4 n
% W- r( V& [! p& U4 Y: f这个是没有滤膜的瓶盖，很好认。这个在培养过程中，如果细胞有二氧化碳的浓度要求 ，那就需要拧松瓶盖。