PCR中，延长退火时间和增加退火的循环次数有什么区别吗？

w343989328

请教一下各位老师师兄师姐。( R$ j. {7 a( `0 j: Z
在实验中，要P一段2000+bp的模版，退火温度降到42℃，还是P不出来。  \0 w7 W0 m) a+ i  X4 `
我想延长退火的时间，但师兄说只有加多循环才可以实现量的提高，我想这两点不都一样吗？还望各位指教。

linzi214

GC含量高的话，可以尝试Takara公司专门针对富含GC的PCR buffer。自己设计的引物要考虑引物行不行的问题，另外，片段大、GC含量高的话，可以将PCR条件设为两段：第一阶段扩增温度低增加模板的含量，第二阶段再增大温度增加产物的特异性。还不行的话，可以在中间再设一个引物分段PCR扩增产物，最后再把产物产物出来后用PCR缝合在在一起。

刘艳85

你可以试着再设计引物，尽量使其符合引物的相关标准，然后再试试。你的延伸温度是多少啊？这个温度你也可以试着调整一下

nankou2008

增加循环次数也不难 你试一次不就知道了   a5 D  ~! b7 n  c9 ]1 T: P3 a, D
个人觉得延长退火时间不会有作用% y& Q5 M: l# T' B" Y6 B" z
我觉得引物最重要 是用的现成的引物 还是自己设计的
/ B4 O* {' O3 E# A+ L如果是自己设计的 还需要多做些摸索 评价吧

鹤顶宏

具体我也太清楚延长退火时间的作用是什么，我当初扩2K的条带是也是不出与目的带大小相符的条带，我试着增加退火时间以后就能看得见了，当然其他的条带也是有出现的，另外按你这种情况，单靠增加循环数也不太可能出现的。

lcxlorna

主要取决于你的模板和引物，延长退火温度不会有什么改善，你的目的条带是完全没有还是量小？有没有杂带？如果有杂带，说明组分没问题（没忘加东西），增加循环次数可能会有点作用，可能是你的引物不理想或模板质量不好。

冷血粒粒

回复 ying 的帖子, o- p6 ~8 w) z8 F9 {% m& A( A

! Z( S% ?# O! `% D我也有同样的疑问：& n" A$ U6 N7 i# q" X
1.我的模板是CDNA7 M( _/ Y+ h9 p* K2 @- h
2.GC含量62.1%( E$ l; A0 F7 B, E/ O( t
3.用的是takara家高保真酶 primestar HS DNA polymerase 4 w2 L# g! v* _5 ^  b  {# e
4.现在的条件是touchdown 程序，从65°递减到55°，循环35个，延伸是2min
/ o, {$ k  f: F5. 序列1 atggcgggac acctcgcttc tgacttcgcc ttctcgcccc cgccgggcgg tggaggcgat
( X8 G) ^5 Z: i: k4 c3 U       61 gggccgggag ggccagagcc gggctgggtt gatcctcgga cctggatgag cttccaaggg8 n3 h' Y1 I% m
      121 cctcccggtg ggtcggggat cgggccgggg gttgtgcctg gcgccgaggt gtgggggctt1 J: p$ _" G" m4 C3 G6 k8 L
      181 cccccgtgcc ccccgcccta tgacttgtgt ggagggatgg cctactgtgc gccgcaggtt
8 q  e0 H+ y5 s- ~      241 ggagtggggc cggtgccccc aggcggcctg gagacccctc agcccgaggg cgaggcggga+ }8 g' R4 @) \
      301 gccggggtgg agagcaactc cgagggggcc tccccggacc cctgcgccgc acccgcaggc
; |( R& J+ U& ?7 k3 [- Q( M" Z      361 gccccgaagc tggacaagga gaagctggag ccgaaccctg aggagtccca ggacatcaaa3 }& R: H9 ?* h& m6 u9 A
      421 gctcttcaga aagaccttga acaatttgcc aagctcctaa agcagaagag gatcacacta
/ |* k9 x! a/ m7 E# H' S, [. k      481 ggatataccc aggccgatgt ggggctcacc ctgggggttc tctttggaaa ggtgttcagc" w( b8 Q3 z7 b2 K( _7 }
      541 caaacgacta tctgccgttt tgaggctttg cagctcagtt tcaagaacat gtgtaagctg2 @3 ?7 C) a6 C% x4 A! B
      601 cggcccctgc tgcagaagtg ggtggaggaa gctgacaaca acgagaatct gcaggagata
# W3 b6 C4 N. y5 k      661 tgcaaggcag agacccttgt gcaggcccga aagagaaagc ggacgagtat cgagaaccga
! E; i# e6 g3 W4 X4 {6 t# z, |4 t      721 gtgagaggca acctggagag catgttcctg cagtgcccga agcccaccct gcagcaaatt+ K9 h4 p' D* x: O( u/ l9 a3 O2 W
      781 agccacatcg cccagcagct cgggctggag aaagacgtgg tccgagtgtg gttttgcaac
6 }. R$ T. t/ T0 I) }+ q      841 cgtcgccaga agggcaaacg atcaagcagt gactactccc aacgtgagga ttttgaggct
9 {" w3 t1 D, X, U      901 gctgggtctc ctttcacagg gggacccgta tcctctcctc tggcgccagg gccccatttt; [, X. [$ Z$ B9 L: q, V, g, p
      961 ggtaccccag gctacggggg gcctcacttc actactctgt actcttcggt cccattccct
' ^+ d8 Q; r% n! C! T     1021 gagggtgagg tctttccctc ggtgtctgtc accgctctgg gctcccctat gcatgcaaac
+ r. ?/ P2 K; t1 Q0 o     1081 tga5 w6 }" N6 _' T1 U5 B$ b
//5 N" y0 n- y7 s3 ^# ~( j
引物- R5 n$ S3 C. \5 t0 ?. I8 F$ ^* w
sense:  5’- GTCCG GATCC  ATT ATGGCGGGAC ACCTCG CTT -3’) t" Y6 _6 t+ C: ~1 `

" T  @' }6 E  ^+ k: Qantisense:  5’- GTTAT CTCGAG TCA AGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTA ! z! s: B$ l# C
GTTTGCATGCATAGGGGAGCC -3’
8 X9 j6 g3 C6 i引物是加入酶切位点的
9 j. o4 F7 V- G8 `6.图片是一个拖带的形状，阳性克隆有条带。

不倒翁

当然不一样了 退火一次只能延伸一次 增加退货时间也没有用的 引物就那么长 一般都用30s就够了 增加退货的次数就相当于增加循环数了 这样产物才可以变多  GC含量怎么样 高的话可以加点DMSO 《=5%就可以

flashlab

有没有设计中间引物呢？延长退火时间你想达到什么目的呢？担心引物没办法结合到模板上吗？试试提高引物的用量

ying

退火时间延长是没有意义的。一般而言30s的时间充分且必要。循环数在特定前提之下确实可以提高产量，但看你说的这种情况，不像是能提高循环数就能做出来的。; s% ]; }3 k+ {# D0 _
几个关键信息，如果你不告诉大家，大家无法帮你分析：
3 |/ \  l! v& J. F$ Z1，模板是cDNA吗？还是基因组？还是细胞或组织？
: n3 P! q( z0 i% ~( G2，模板的GC含量如何？  N$ J: J2 {0 v* `! m
3，你用的是什么公司的什么酶？至少要告诉我是普通的Taq还是KOD之类的高保真酶？
& a/ d0 C4 p2 ^% q4，你现在的反应条件。你现在PCR圈是数是多少？延伸反应时间是多少？
6 V8 `* Q3 }1 f5，你最好把你的2000多bp的序列贴出来，（不仅要包括目的序列本身，还要告诉我们目的序列之前和之后各100以上bp的序列），再把你的引物序列贴出来，大家可以帮你看看引物是不是有问题。你设计引物时设计的Tm值是多少度？& O6 }7 D3 K8 U( u7 A% i& s9 @
6，你所谓P不出来，是完全没有任何条带吗？还是没有P出来目的条带，但是有其它大小的条带？还是是一个拖带的形状？你最好把胶图贴出来，便于大家分析。你确定不是PCR体系本身的原因吗？有带一个阳性对照吗（就是你实验室其他的人曾经P出来的序列，你使用他们的引物和模板，确实能够P出来他们所P出来的序列，但是同时做的实验里面你自己的PCR没有P出来）？