PCR中，延长退火时间和增加退火的循环次数有什么区别吗？

w343989328

请教一下各位老师师兄师姐。
2 M" c4 w# s0 `- a2 N0 {6 x在实验中，要P一段2000+bp的模版，退火温度降到42℃，还是P不出来。/ r! e0 k( j: Q( U
我想延长退火的时间，但师兄说只有加多循环才可以实现量的提高，我想这两点不都一样吗？还望各位指教。

ying

退火时间延长是没有意义的。一般而言30s的时间充分且必要。循环数在特定前提之下确实可以提高产量，但看你说的这种情况，不像是能提高循环数就能做出来的。5 y: R5 O5 d' r$ e5 z
几个关键信息，如果你不告诉大家，大家无法帮你分析：
. ^% R, F7 o4 d/ E. O6 t1，模板是cDNA吗？还是基因组？还是细胞或组织？
+ L2 [; i8 V9 m2，模板的GC含量如何？
$ T/ T6 n! f% q9 G2 j( h5 w% r3，你用的是什么公司的什么酶？至少要告诉我是普通的Taq还是KOD之类的高保真酶？  J, j9 q, w; F: S
4，你现在的反应条件。你现在PCR圈是数是多少？延伸反应时间是多少？8 I) s2 n+ ^" \  Q7 V) b
5，你最好把你的2000多bp的序列贴出来，（不仅要包括目的序列本身，还要告诉我们目的序列之前和之后各100以上bp的序列），再把你的引物序列贴出来，大家可以帮你看看引物是不是有问题。你设计引物时设计的Tm值是多少度？
( W) m4 x; k( x! l. W6，你所谓P不出来，是完全没有任何条带吗？还是没有P出来目的条带，但是有其它大小的条带？还是是一个拖带的形状？你最好把胶图贴出来，便于大家分析。你确定不是PCR体系本身的原因吗？有带一个阳性对照吗（就是你实验室其他的人曾经P出来的序列，你使用他们的引物和模板，确实能够P出来他们所P出来的序列，但是同时做的实验里面你自己的PCR没有P出来）？

flashlab

有没有设计中间引物呢？延长退火时间你想达到什么目的呢？担心引物没办法结合到模板上吗？试试提高引物的用量

不倒翁

当然不一样了 退火一次只能延伸一次 增加退货时间也没有用的 引物就那么长 一般都用30s就够了 增加退货的次数就相当于增加循环数了 这样产物才可以变多  GC含量怎么样 高的话可以加点DMSO 《=5%就可以

冷血粒粒

回复 ying 的帖子% w/ `0 W2 K5 z4 k
+ {5 k1 j9 g+ P8 r! w$ V9 X$ n7 K
我也有同样的疑问：
: Z/ Q/ v; G, o7 V1.我的模板是CDNA/ N  M0 u8 u; i: M
2.GC含量62.1%& K: u4 |# C, B$ r3 @/ s
3.用的是takara家高保真酶 primestar HS DNA polymerase 0 O( _$ h$ s, L, d/ |9 _" `  z( P. D
4.现在的条件是touchdown 程序，从65°递减到55°，循环35个，延伸是2min / ]3 c1 ^% V$ h
5. 序列1 atggcgggac acctcgcttc tgacttcgcc ttctcgcccc cgccgggcgg tggaggcgat, B0 ^- a$ {0 e- e  l+ A% v1 s
       61 gggccgggag ggccagagcc gggctgggtt gatcctcgga cctggatgag cttccaaggg
4 e! l7 U" `  i4 V& A+ f      121 cctcccggtg ggtcggggat cgggccgggg gttgtgcctg gcgccgaggt gtgggggctt* R' }1 w+ q6 Q! Y8 q  e) x
      181 cccccgtgcc ccccgcccta tgacttgtgt ggagggatgg cctactgtgc gccgcaggtt! ^& G8 k" Z# b, p7 M
      241 ggagtggggc cggtgccccc aggcggcctg gagacccctc agcccgaggg cgaggcggga& `2 r' x* V4 F, i. r' K* [( s3 t7 H
      301 gccggggtgg agagcaactc cgagggggcc tccccggacc cctgcgccgc acccgcaggc
/ d  q5 M: Z; w$ `      361 gccccgaagc tggacaagga gaagctggag ccgaaccctg aggagtccca ggacatcaaa# B( p6 G0 K' i# A! ]- p
      421 gctcttcaga aagaccttga acaatttgcc aagctcctaa agcagaagag gatcacacta5 L5 A# n+ K8 Y
      481 ggatataccc aggccgatgt ggggctcacc ctgggggttc tctttggaaa ggtgttcagc- r* E5 Z9 ?4 d% Y  c
      541 caaacgacta tctgccgttt tgaggctttg cagctcagtt tcaagaacat gtgtaagctg6 {$ l# D. u+ P6 n- o( }1 T
      601 cggcccctgc tgcagaagtg ggtggaggaa gctgacaaca acgagaatct gcaggagata3 r7 e3 e& M+ C: S. l
      661 tgcaaggcag agacccttgt gcaggcccga aagagaaagc ggacgagtat cgagaaccga' k& [' g  X3 z5 `, `5 @& G
      721 gtgagaggca acctggagag catgttcctg cagtgcccga agcccaccct gcagcaaatt7 Q2 V! K8 _6 b' E9 y
      781 agccacatcg cccagcagct cgggctggag aaagacgtgg tccgagtgtg gttttgcaac. _/ G$ O+ z& X" ~" v0 H
      841 cgtcgccaga agggcaaacg atcaagcagt gactactccc aacgtgagga ttttgaggct* b: w, k; a& i6 Y; L0 u
      901 gctgggtctc ctttcacagg gggacccgta tcctctcctc tggcgccagg gccccatttt
8 V  Z( r; \& U& T5 ?      961 ggtaccccag gctacggggg gcctcacttc actactctgt actcttcggt cccattccct4 Y3 q( [$ x! h2 w
     1021 gagggtgagg tctttccctc ggtgtctgtc accgctctgg gctcccctat gcatgcaaac2 i5 S5 Q0 s* t5 r% j$ T( ]& D
     1081 tga- d. }0 V# p* Z! K5 g
//% L: _! T2 N( n2 Z  V) m( v; {# l
引物
5 Z: _! o  L( Z# j/ rsense:  5’- GTCCG GATCC  ATT ATGGCGGGAC ACCTCG CTT -3’$ U/ w2 k  e5 d) t. ^9 |% v5 ^0 H
" m% D6 W, \: r: x( R& }
antisense:  5’- GTTAT CTCGAG TCA AGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTA . [# @) m- M- }# y' [
GTTTGCATGCATAGGGGAGCC -3’
; ~% N) |+ T# L) w引物是加入酶切位点的. \* q* S9 R3 l
6.图片是一个拖带的形状，阳性克隆有条带。

lcxlorna

主要取决于你的模板和引物，延长退火温度不会有什么改善，你的目的条带是完全没有还是量小？有没有杂带？如果有杂带，说明组分没问题（没忘加东西），增加循环次数可能会有点作用，可能是你的引物不理想或模板质量不好。

鹤顶宏

具体我也太清楚延长退火时间的作用是什么，我当初扩2K的条带是也是不出与目的带大小相符的条带，我试着增加退火时间以后就能看得见了，当然其他的条带也是有出现的，另外按你这种情况，单靠增加循环数也不太可能出现的。

nankou2008

增加循环次数也不难 你试一次不就知道了 1 M- r( T) Q3 l$ N6 ]
个人觉得延长退火时间不会有作用1 l  o& F1 ^6 H3 Z9 \
我觉得引物最重要 是用的现成的引物 还是自己设计的
! F) Z, Z+ f7 @/ C如果是自己设计的 还需要多做些摸索 评价吧

刘艳85

你可以试着再设计引物，尽量使其符合引物的相关标准，然后再试试。你的延伸温度是多少啊？这个温度你也可以试着调整一下

linzi214

GC含量高的话，可以尝试Takara公司专门针对富含GC的PCR buffer。自己设计的引物要考虑引物行不行的问题，另外，片段大、GC含量高的话，可以将PCR条件设为两段：第一阶段扩增温度低增加模板的含量，第二阶段再增大温度增加产物的特异性。还不行的话，可以在中间再设一个引物分段PCR扩增产物，最后再把产物产物出来后用PCR缝合在在一起。