PCR中，延长退火时间和增加退火的循环次数有什么区别吗？

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请教一下各位老师师兄师姐。9 j+ i* C- l: B! @5 H  O; |
在实验中，要P一段2000+bp的模版，退火温度降到42℃，还是P不出来。
7 v; M: O% K4 s5 t; }! K* Z我想延长退火的时间，但师兄说只有加多循环才可以实现量的提高，我想这两点不都一样吗？还望各位指教。

ying

退火时间延长是没有意义的。一般而言30s的时间充分且必要。循环数在特定前提之下确实可以提高产量，但看你说的这种情况，不像是能提高循环数就能做出来的。
5 y" ]0 A5 L& I$ i: ~  Q几个关键信息，如果你不告诉大家，大家无法帮你分析：! E6 ]8 j' x4 F* _
1，模板是cDNA吗？还是基因组？还是细胞或组织？
" @! k6 l$ j" S6 a2，模板的GC含量如何？  \* v- z4 B/ X8 H. d& V
3，你用的是什么公司的什么酶？至少要告诉我是普通的Taq还是KOD之类的高保真酶？* v$ E! g3 E& \
4，你现在的反应条件。你现在PCR圈是数是多少？延伸反应时间是多少？
, \3 e5 ?1 s) x& V) m0 F& a5，你最好把你的2000多bp的序列贴出来，（不仅要包括目的序列本身，还要告诉我们目的序列之前和之后各100以上bp的序列），再把你的引物序列贴出来，大家可以帮你看看引物是不是有问题。你设计引物时设计的Tm值是多少度？" H+ Q2 i2 L8 ^, I$ z
6，你所谓P不出来，是完全没有任何条带吗？还是没有P出来目的条带，但是有其它大小的条带？还是是一个拖带的形状？你最好把胶图贴出来，便于大家分析。你确定不是PCR体系本身的原因吗？有带一个阳性对照吗（就是你实验室其他的人曾经P出来的序列，你使用他们的引物和模板，确实能够P出来他们所P出来的序列，但是同时做的实验里面你自己的PCR没有P出来）？

flashlab

有没有设计中间引物呢？延长退火时间你想达到什么目的呢？担心引物没办法结合到模板上吗？试试提高引物的用量

不倒翁

当然不一样了 退火一次只能延伸一次 增加退货时间也没有用的 引物就那么长 一般都用30s就够了 增加退货的次数就相当于增加循环数了 这样产物才可以变多  GC含量怎么样 高的话可以加点DMSO 《=5%就可以

冷血粒粒

回复 ying 的帖子% i0 k- G; a* E9 W; I; ~$ }: v% y. @
1 I6 d0 v8 L4 _% P/ W
我也有同样的疑问：6 Q1 N) Q  g  u: s  j5 {
1.我的模板是CDNA
2 ?& l( M: M; j+ N# D4 t2.GC含量62.1%) D$ e# \. ]& V1 J. l+ y
3.用的是takara家高保真酶 primestar HS DNA polymerase . |1 x5 [3 S5 B
4.现在的条件是touchdown 程序，从65°递减到55°，循环35个，延伸是2min
6 ^; M3 o; k: V5. 序列1 atggcgggac acctcgcttc tgacttcgcc ttctcgcccc cgccgggcgg tggaggcgat: u( k0 M2 a; z- F3 o" x9 |
       61 gggccgggag ggccagagcc gggctgggtt gatcctcgga cctggatgag cttccaaggg
' C  i' R. b3 U3 Y& ~% j' l      121 cctcccggtg ggtcggggat cgggccgggg gttgtgcctg gcgccgaggt gtgggggctt9 c! N" n+ {$ K: b+ |$ U' w' T
      181 cccccgtgcc ccccgcccta tgacttgtgt ggagggatgg cctactgtgc gccgcaggtt1 j) R" _. g+ Y- M  }7 d
      241 ggagtggggc cggtgccccc aggcggcctg gagacccctc agcccgaggg cgaggcggga
; s2 I; J, \) h  X      301 gccggggtgg agagcaactc cgagggggcc tccccggacc cctgcgccgc acccgcaggc
% F: c: I1 W1 B- z+ j# h5 a) P      361 gccccgaagc tggacaagga gaagctggag ccgaaccctg aggagtccca ggacatcaaa! m7 O# s' y* b$ z- ?8 j6 z
      421 gctcttcaga aagaccttga acaatttgcc aagctcctaa agcagaagag gatcacacta
& N" L8 k1 I* Y: W      481 ggatataccc aggccgatgt ggggctcacc ctgggggttc tctttggaaa ggtgttcagc/ |; k2 s' R1 ]- t& x6 B9 z
      541 caaacgacta tctgccgttt tgaggctttg cagctcagtt tcaagaacat gtgtaagctg3 K( [) U( {2 ]/ c; ~8 O( A  F- u
      601 cggcccctgc tgcagaagtg ggtggaggaa gctgacaaca acgagaatct gcaggagata6 K$ u, i$ k7 q5 d. B6 ]7 E
      661 tgcaaggcag agacccttgt gcaggcccga aagagaaagc ggacgagtat cgagaaccga
# f% z, r/ z$ Z, ^& Y      721 gtgagaggca acctggagag catgttcctg cagtgcccga agcccaccct gcagcaaatt
6 \" m* o& n0 s8 o# s8 v8 N, F, w5 H      781 agccacatcg cccagcagct cgggctggag aaagacgtgg tccgagtgtg gttttgcaac
9 S/ y/ ^# c& s0 `$ G6 ?/ T# L      841 cgtcgccaga agggcaaacg atcaagcagt gactactccc aacgtgagga ttttgaggct
3 C% q# J1 g# ~/ k7 z3 ?      901 gctgggtctc ctttcacagg gggacccgta tcctctcctc tggcgccagg gccccatttt
3 m0 @" E) @7 L5 F( R# ^' q      961 ggtaccccag gctacggggg gcctcacttc actactctgt actcttcggt cccattccct3 z9 Y6 i0 I# D4 }6 I$ @, S0 H! _
     1021 gagggtgagg tctttccctc ggtgtctgtc accgctctgg gctcccctat gcatgcaaac) C& l4 {, B0 f! a5 F
     1081 tga
0 `( y  N( |! v# l( I8 j  Y//4 F. G% [: k& `' B, G. ~
引物
! O5 N9 K' r, C( r8 f! A' t& E: t* Qsense:  5’- GTCCG GATCC  ATT ATGGCGGGAC ACCTCG CTT -3’% L9 W; a0 T, `! d# e: d4 f0 _3 C- O
3 u% Q! Z" C$ _$ i1 U( P  L* g
antisense:  5’- GTTAT CTCGAG TCA AGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTA ! A. z  e6 u( `& @/ J" u) n
GTTTGCATGCATAGGGGAGCC -3’& c& Y/ z" j$ O$ ]1 v! D
引物是加入酶切位点的
- a4 }( v- V5 @8 e- P6.图片是一个拖带的形状，阳性克隆有条带。

lcxlorna

主要取决于你的模板和引物，延长退火温度不会有什么改善，你的目的条带是完全没有还是量小？有没有杂带？如果有杂带，说明组分没问题（没忘加东西），增加循环次数可能会有点作用，可能是你的引物不理想或模板质量不好。

鹤顶宏

具体我也太清楚延长退火时间的作用是什么，我当初扩2K的条带是也是不出与目的带大小相符的条带，我试着增加退火时间以后就能看得见了，当然其他的条带也是有出现的，另外按你这种情况，单靠增加循环数也不太可能出现的。

nankou2008

增加循环次数也不难 你试一次不就知道了 & c1 n( T7 d+ v7 i, I; ^7 J
个人觉得延长退火时间不会有作用
* a" k' Z& T0 z& _8 v我觉得引物最重要 是用的现成的引物 还是自己设计的: K8 e) p* r( Y$ w1 U' F# P0 M
如果是自己设计的 还需要多做些摸索 评价吧

刘艳85

你可以试着再设计引物，尽量使其符合引物的相关标准，然后再试试。你的延伸温度是多少啊？这个温度你也可以试着调整一下

linzi214

GC含量高的话，可以尝试Takara公司专门针对富含GC的PCR buffer。自己设计的引物要考虑引物行不行的问题，另外，片段大、GC含量高的话，可以将PCR条件设为两段：第一阶段扩增温度低增加模板的含量，第二阶段再增大温度增加产物的特异性。还不行的话，可以在中间再设一个引物分段PCR扩增产物，最后再把产物产物出来后用PCR缝合在在一起。