PCR中，延长退火时间和增加退火的循环次数有什么区别吗？

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请教一下各位老师师兄师姐。
- w0 @- {' T4 n# e- y$ q+ B在实验中，要P一段2000+bp的模版，退火温度降到42℃，还是P不出来。
7 Y( M) k+ k. c我想延长退火的时间，但师兄说只有加多循环才可以实现量的提高，我想这两点不都一样吗？还望各位指教。

ying

退火时间延长是没有意义的。一般而言30s的时间充分且必要。循环数在特定前提之下确实可以提高产量，但看你说的这种情况，不像是能提高循环数就能做出来的。
5 f# ^4 Y- H0 W9 m几个关键信息，如果你不告诉大家，大家无法帮你分析：
0 d: ~" Q( n) c9 a/ h1，模板是cDNA吗？还是基因组？还是细胞或组织？$ x' B2 |( D0 U+ D* G$ j
2，模板的GC含量如何？! d. D9 t+ ^! [! Q% v
3，你用的是什么公司的什么酶？至少要告诉我是普通的Taq还是KOD之类的高保真酶？
1 v+ M: j4 u3 C* k& c6 w3 z1 p4，你现在的反应条件。你现在PCR圈是数是多少？延伸反应时间是多少？: S0 z# \" O. o
5，你最好把你的2000多bp的序列贴出来，（不仅要包括目的序列本身，还要告诉我们目的序列之前和之后各100以上bp的序列），再把你的引物序列贴出来，大家可以帮你看看引物是不是有问题。你设计引物时设计的Tm值是多少度？! A. l1 n& p" |( M4 p& n
6，你所谓P不出来，是完全没有任何条带吗？还是没有P出来目的条带，但是有其它大小的条带？还是是一个拖带的形状？你最好把胶图贴出来，便于大家分析。你确定不是PCR体系本身的原因吗？有带一个阳性对照吗（就是你实验室其他的人曾经P出来的序列，你使用他们的引物和模板，确实能够P出来他们所P出来的序列，但是同时做的实验里面你自己的PCR没有P出来）？

flashlab

有没有设计中间引物呢？延长退火时间你想达到什么目的呢？担心引物没办法结合到模板上吗？试试提高引物的用量

不倒翁

当然不一样了 退火一次只能延伸一次 增加退货时间也没有用的 引物就那么长 一般都用30s就够了 增加退货的次数就相当于增加循环数了 这样产物才可以变多  GC含量怎么样 高的话可以加点DMSO 《=5%就可以

冷血粒粒

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" G* x- ]7 e( b/ S- w9 `
# H9 P" _( z* p7 g6 v4 I5 w) b+ v+ s我也有同样的疑问：3 p4 l& o" C; W0 d6 e! c! M! K
1.我的模板是CDNA" o* i4 e# y% d
2.GC含量62.1%; [1 h1 A9 A6 ]; K; {" o' G
3.用的是takara家高保真酶 primestar HS DNA polymerase
! F: S' @% o; Q' }+ p. g+ U, [4.现在的条件是touchdown 程序，从65°递减到55°，循环35个，延伸是2min
$ k6 U) d  }+ j/ s) Y5. 序列1 atggcgggac acctcgcttc tgacttcgcc ttctcgcccc cgccgggcgg tggaggcgat. j- W! Z1 v! i
       61 gggccgggag ggccagagcc gggctgggtt gatcctcgga cctggatgag cttccaaggg- ~! y4 K, Y5 @) \& S; T
      121 cctcccggtg ggtcggggat cgggccgggg gttgtgcctg gcgccgaggt gtgggggctt( J# B9 Q- [, X7 O6 [
      181 cccccgtgcc ccccgcccta tgacttgtgt ggagggatgg cctactgtgc gccgcaggtt
* Z" y. F" g! {$ w: g      241 ggagtggggc cggtgccccc aggcggcctg gagacccctc agcccgaggg cgaggcggga
) q& p) z; u" C      301 gccggggtgg agagcaactc cgagggggcc tccccggacc cctgcgccgc acccgcaggc, g9 I" k: i% {3 l
      361 gccccgaagc tggacaagga gaagctggag ccgaaccctg aggagtccca ggacatcaaa
) ~& u) B' w; n0 X      421 gctcttcaga aagaccttga acaatttgcc aagctcctaa agcagaagag gatcacacta$ E; g; M5 {* D% b2 I0 K& _
      481 ggatataccc aggccgatgt ggggctcacc ctgggggttc tctttggaaa ggtgttcagc
; T" B: q5 G! i1 _      541 caaacgacta tctgccgttt tgaggctttg cagctcagtt tcaagaacat gtgtaagctg
# U+ v  }2 t/ Z      601 cggcccctgc tgcagaagtg ggtggaggaa gctgacaaca acgagaatct gcaggagata! `2 j& e0 }" i) r% c
      661 tgcaaggcag agacccttgt gcaggcccga aagagaaagc ggacgagtat cgagaaccga
8 W6 @& a) d. Q( F0 ~& u( b      721 gtgagaggca acctggagag catgttcctg cagtgcccga agcccaccct gcagcaaatt) H6 L) N6 Z, n* a. M
      781 agccacatcg cccagcagct cgggctggag aaagacgtgg tccgagtgtg gttttgcaac
6 ?" [' B: ?' I. J, `' b8 p      841 cgtcgccaga agggcaaacg atcaagcagt gactactccc aacgtgagga ttttgaggct
4 y  _: t* m+ v      901 gctgggtctc ctttcacagg gggacccgta tcctctcctc tggcgccagg gccccatttt
  g% [! ~/ P) \. x5 C4 R      961 ggtaccccag gctacggggg gcctcacttc actactctgt actcttcggt cccattccct
/ `( l6 [3 B8 Y( h3 G     1021 gagggtgagg tctttccctc ggtgtctgtc accgctctgg gctcccctat gcatgcaaac& D9 b  ]7 M& L) }: {
     1081 tga
- p- M( f* J4 J$ W//
, P* F) @! G& j$ G! _& Q- u引物& R2 |/ Z5 M0 l
sense:  5’- GTCCG GATCC  ATT ATGGCGGGAC ACCTCG CTT -3’
: l6 J# P/ d) f; L3 o2 k' X+ S1 K0 C
antisense:  5’- GTTAT CTCGAG TCA AGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTA 5 k& h0 |" u) ~% z, {
GTTTGCATGCATAGGGGAGCC -3’
3 t5 J! H( [; O2 B' k4 e( f+ d' A8 c引物是加入酶切位点的
/ Q! Y: j9 r& B4 C6.图片是一个拖带的形状，阳性克隆有条带。

lcxlorna

主要取决于你的模板和引物，延长退火温度不会有什么改善，你的目的条带是完全没有还是量小？有没有杂带？如果有杂带，说明组分没问题（没忘加东西），增加循环次数可能会有点作用，可能是你的引物不理想或模板质量不好。

鹤顶宏

具体我也太清楚延长退火时间的作用是什么，我当初扩2K的条带是也是不出与目的带大小相符的条带，我试着增加退火时间以后就能看得见了，当然其他的条带也是有出现的，另外按你这种情况，单靠增加循环数也不太可能出现的。

nankou2008

增加循环次数也不难 你试一次不就知道了
3 C: o7 T1 }' O! u( m' M4 E个人觉得延长退火时间不会有作用
$ I6 E7 B5 \3 }- p( e8 I, B! l我觉得引物最重要 是用的现成的引物 还是自己设计的
/ p, Y/ A2 u8 q  a4 w" ?% P如果是自己设计的 还需要多做些摸索 评价吧

刘艳85

你可以试着再设计引物，尽量使其符合引物的相关标准，然后再试试。你的延伸温度是多少啊？这个温度你也可以试着调整一下

linzi214

GC含量高的话，可以尝试Takara公司专门针对富含GC的PCR buffer。自己设计的引物要考虑引物行不行的问题，另外，片段大、GC含量高的话，可以将PCR条件设为两段：第一阶段扩增温度低增加模板的含量，第二阶段再增大温度增加产物的特异性。还不行的话，可以在中间再设一个引物分段PCR扩增产物，最后再把产物产物出来后用PCR缝合在在一起。