PCR中，延长退火时间和增加退火的循环次数有什么区别吗？

w343989328

请教一下各位老师师兄师姐。
+ O, w# q" b4 c5 w, X在实验中，要P一段2000+bp的模版，退火温度降到42℃，还是P不出来。# c. t: z( ^: e
我想延长退火的时间，但师兄说只有加多循环才可以实现量的提高，我想这两点不都一样吗？还望各位指教。

ying

退火时间延长是没有意义的。一般而言30s的时间充分且必要。循环数在特定前提之下确实可以提高产量，但看你说的这种情况，不像是能提高循环数就能做出来的。8 |- J/ S* h- Q4 z; z
几个关键信息，如果你不告诉大家，大家无法帮你分析：
- N6 m; f! _5 o3 C8 R% M1，模板是cDNA吗？还是基因组？还是细胞或组织？
- N0 s% J# J% u# X! R! B2，模板的GC含量如何？
+ l6 l. \- |: a, f( ?/ z- {* g3，你用的是什么公司的什么酶？至少要告诉我是普通的Taq还是KOD之类的高保真酶？' [+ k( M4 D$ v: v: N- q4 R# }3 R
4，你现在的反应条件。你现在PCR圈是数是多少？延伸反应时间是多少？' f% ]2 i" a  @2 \5 n  U
5，你最好把你的2000多bp的序列贴出来，（不仅要包括目的序列本身，还要告诉我们目的序列之前和之后各100以上bp的序列），再把你的引物序列贴出来，大家可以帮你看看引物是不是有问题。你设计引物时设计的Tm值是多少度？
) D/ ^' J! l: f- L* M  c) m6，你所谓P不出来，是完全没有任何条带吗？还是没有P出来目的条带，但是有其它大小的条带？还是是一个拖带的形状？你最好把胶图贴出来，便于大家分析。你确定不是PCR体系本身的原因吗？有带一个阳性对照吗（就是你实验室其他的人曾经P出来的序列，你使用他们的引物和模板，确实能够P出来他们所P出来的序列，但是同时做的实验里面你自己的PCR没有P出来）？

flashlab

有没有设计中间引物呢？延长退火时间你想达到什么目的呢？担心引物没办法结合到模板上吗？试试提高引物的用量

不倒翁

当然不一样了 退火一次只能延伸一次 增加退货时间也没有用的 引物就那么长 一般都用30s就够了 增加退货的次数就相当于增加循环数了 这样产物才可以变多  GC含量怎么样 高的话可以加点DMSO 《=5%就可以

冷血粒粒

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: `, W- `3 b* Z
1 N, O6 S" N8 m我也有同样的疑问：
. S0 H: X4 Y$ u) b$ f$ ~" w1.我的模板是CDNA0 N/ c6 E. @. h7 V" p$ R
2.GC含量62.1%
( A0 G  a3 p: U& Z1 H3.用的是takara家高保真酶 primestar HS DNA polymerase
3 o! C7 f, K6 e4 s4.现在的条件是touchdown 程序，从65°递减到55°，循环35个，延伸是2min ' L- A8 ]; w: h7 N4 j
5. 序列1 atggcgggac acctcgcttc tgacttcgcc ttctcgcccc cgccgggcgg tggaggcgat8 j  U. \+ E) E4 I3 y: e: I5 j4 F
       61 gggccgggag ggccagagcc gggctgggtt gatcctcgga cctggatgag cttccaaggg4 {/ N" D* Q. U- s" x
      121 cctcccggtg ggtcggggat cgggccgggg gttgtgcctg gcgccgaggt gtgggggctt& ^( s; a! s. r4 l# |
      181 cccccgtgcc ccccgcccta tgacttgtgt ggagggatgg cctactgtgc gccgcaggtt+ x+ U6 b. D+ ?1 w' i9 W
      241 ggagtggggc cggtgccccc aggcggcctg gagacccctc agcccgaggg cgaggcggga
3 w4 c4 P8 K9 N% r( K      301 gccggggtgg agagcaactc cgagggggcc tccccggacc cctgcgccgc acccgcaggc
1 D4 z3 j2 ]9 O2 |8 y) t      361 gccccgaagc tggacaagga gaagctggag ccgaaccctg aggagtccca ggacatcaaa9 Q, p- C& R9 S
      421 gctcttcaga aagaccttga acaatttgcc aagctcctaa agcagaagag gatcacacta7 w3 }! i8 a3 n, v3 f8 J' c
      481 ggatataccc aggccgatgt ggggctcacc ctgggggttc tctttggaaa ggtgttcagc/ W6 z  k4 |( K8 h6 {5 x1 T
      541 caaacgacta tctgccgttt tgaggctttg cagctcagtt tcaagaacat gtgtaagctg$ C8 O2 W4 @; `
      601 cggcccctgc tgcagaagtg ggtggaggaa gctgacaaca acgagaatct gcaggagata! m9 r& H# m  ]1 R% n- x
      661 tgcaaggcag agacccttgt gcaggcccga aagagaaagc ggacgagtat cgagaaccga, B% j; [1 N0 l: q# E, b
      721 gtgagaggca acctggagag catgttcctg cagtgcccga agcccaccct gcagcaaatt6 K* o" k( |! S) i- e9 t
      781 agccacatcg cccagcagct cgggctggag aaagacgtgg tccgagtgtg gttttgcaac! D* H, s/ c, f9 J
      841 cgtcgccaga agggcaaacg atcaagcagt gactactccc aacgtgagga ttttgaggct. j# o' c8 Z* U7 v9 ]# R
      901 gctgggtctc ctttcacagg gggacccgta tcctctcctc tggcgccagg gccccatttt; e+ B0 C. \# ^
      961 ggtaccccag gctacggggg gcctcacttc actactctgt actcttcggt cccattccct  b% R  h6 G* _& O
     1021 gagggtgagg tctttccctc ggtgtctgtc accgctctgg gctcccctat gcatgcaaac! k" T! b" t3 N! F# X
     1081 tga
" h2 z4 T9 |# N7 s6 U//
# j% i4 e2 m2 G引物8 e* Z0 d" u/ V# {2 E4 x
sense:  5’- GTCCG GATCC  ATT ATGGCGGGAC ACCTCG CTT -3’
2 `- _: _0 x% N# X1 L2 w2 t( m* ]  u# c8 D' Z+ ]! J6 B
antisense:  5’- GTTAT CTCGAG TCA AGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTA
6 O3 A/ h3 s& |2 [* P5 PGTTTGCATGCATAGGGGAGCC -3’. Y( z3 E" w% H8 K7 O% U( l
引物是加入酶切位点的
: \8 K/ m! k  l; L- o6.图片是一个拖带的形状，阳性克隆有条带。

lcxlorna

主要取决于你的模板和引物，延长退火温度不会有什么改善，你的目的条带是完全没有还是量小？有没有杂带？如果有杂带，说明组分没问题（没忘加东西），增加循环次数可能会有点作用，可能是你的引物不理想或模板质量不好。

鹤顶宏

具体我也太清楚延长退火时间的作用是什么，我当初扩2K的条带是也是不出与目的带大小相符的条带，我试着增加退火时间以后就能看得见了，当然其他的条带也是有出现的，另外按你这种情况，单靠增加循环数也不太可能出现的。

nankou2008

增加循环次数也不难 你试一次不就知道了 / e9 a* E' `0 [4 d) u* P9 u4 d9 o
个人觉得延长退火时间不会有作用
0 n- g) ~, W" h, v; U我觉得引物最重要 是用的现成的引物 还是自己设计的4 D  z5 b  A$ n* A- R$ j/ b
如果是自己设计的 还需要多做些摸索 评价吧

刘艳85

你可以试着再设计引物，尽量使其符合引物的相关标准，然后再试试。你的延伸温度是多少啊？这个温度你也可以试着调整一下

linzi214

GC含量高的话，可以尝试Takara公司专门针对富含GC的PCR buffer。自己设计的引物要考虑引物行不行的问题，另外，片段大、GC含量高的话，可以将PCR条件设为两段：第一阶段扩增温度低增加模板的含量，第二阶段再增大温度增加产物的特异性。还不行的话，可以在中间再设一个引物分段PCR扩增产物，最后再把产物产物出来后用PCR缝合在在一起。