PCR中，延长退火时间和增加退火的循环次数有什么区别吗？

w343989328

请教一下各位老师师兄师姐。
' v# H: u. m1 P; V6 I6 }  W# j- E% r在实验中，要P一段2000+bp的模版，退火温度降到42℃，还是P不出来。
& k/ M. [& r; C3 o" P我想延长退火的时间，但师兄说只有加多循环才可以实现量的提高，我想这两点不都一样吗？还望各位指教。

ying

退火时间延长是没有意义的。一般而言30s的时间充分且必要。循环数在特定前提之下确实可以提高产量，但看你说的这种情况，不像是能提高循环数就能做出来的。
7 g. g% V, v' v5 i/ p0 C几个关键信息，如果你不告诉大家，大家无法帮你分析：
' |4 Q8 |' H+ S3 c8 ^3 O0 ?3 M* J1，模板是cDNA吗？还是基因组？还是细胞或组织？
/ Q8 O6 i, \& o3 k2，模板的GC含量如何？# L$ {; h/ }3 l  N+ A; u+ s
3，你用的是什么公司的什么酶？至少要告诉我是普通的Taq还是KOD之类的高保真酶？
" V' D( u  S4 v* w  }; b9 e3 X4，你现在的反应条件。你现在PCR圈是数是多少？延伸反应时间是多少？6 h1 c9 h7 z' F
5，你最好把你的2000多bp的序列贴出来，（不仅要包括目的序列本身，还要告诉我们目的序列之前和之后各100以上bp的序列），再把你的引物序列贴出来，大家可以帮你看看引物是不是有问题。你设计引物时设计的Tm值是多少度？* c7 ]& @# N) a6 m# k3 B+ h
6，你所谓P不出来，是完全没有任何条带吗？还是没有P出来目的条带，但是有其它大小的条带？还是是一个拖带的形状？你最好把胶图贴出来，便于大家分析。你确定不是PCR体系本身的原因吗？有带一个阳性对照吗（就是你实验室其他的人曾经P出来的序列，你使用他们的引物和模板，确实能够P出来他们所P出来的序列，但是同时做的实验里面你自己的PCR没有P出来）？

flashlab

有没有设计中间引物呢？延长退火时间你想达到什么目的呢？担心引物没办法结合到模板上吗？试试提高引物的用量

不倒翁

当然不一样了 退火一次只能延伸一次 增加退货时间也没有用的 引物就那么长 一般都用30s就够了 增加退货的次数就相当于增加循环数了 这样产物才可以变多  GC含量怎么样 高的话可以加点DMSO 《=5%就可以

冷血粒粒

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( `- b' _# C( w  q' ]! `6 @$ }) C
& g) p  U( H4 M4 E: F9 O5 Q5 W我也有同样的疑问：
6 m: V; o' w! `1.我的模板是CDNA
$ N( y+ }; X* v' d4 C8 A! n8 y2.GC含量62.1%
+ X4 j6 A2 e% @3.用的是takara家高保真酶 primestar HS DNA polymerase
# Y& _# p  T# Z' `4.现在的条件是touchdown 程序，从65°递减到55°，循环35个，延伸是2min 3 M# v( D& e1 f
5. 序列1 atggcgggac acctcgcttc tgacttcgcc ttctcgcccc cgccgggcgg tggaggcgat2 m, w0 k$ B4 v. k' O6 n' r
       61 gggccgggag ggccagagcc gggctgggtt gatcctcgga cctggatgag cttccaaggg
+ Z/ B! p7 N7 p1 G8 ~9 n6 f7 G5 E  o! T      121 cctcccggtg ggtcggggat cgggccgggg gttgtgcctg gcgccgaggt gtgggggctt
, }0 c( g% T4 k- ]      181 cccccgtgcc ccccgcccta tgacttgtgt ggagggatgg cctactgtgc gccgcaggtt0 f! ?. {' G6 z! g% B
      241 ggagtggggc cggtgccccc aggcggcctg gagacccctc agcccgaggg cgaggcggga
& x3 |9 Z- ?/ s# ?      301 gccggggtgg agagcaactc cgagggggcc tccccggacc cctgcgccgc acccgcaggc
3 ]) V3 v3 [' Q7 K      361 gccccgaagc tggacaagga gaagctggag ccgaaccctg aggagtccca ggacatcaaa1 T5 x  x6 w' ?8 t& C1 x( ]
      421 gctcttcaga aagaccttga acaatttgcc aagctcctaa agcagaagag gatcacacta
9 i( C/ e5 \2 i$ r0 s      481 ggatataccc aggccgatgt ggggctcacc ctgggggttc tctttggaaa ggtgttcagc
+ i) W) N' a9 i2 `7 D# U      541 caaacgacta tctgccgttt tgaggctttg cagctcagtt tcaagaacat gtgtaagctg
* g1 R4 t2 \8 ?      601 cggcccctgc tgcagaagtg ggtggaggaa gctgacaaca acgagaatct gcaggagata: ~/ Z4 P! Q$ S% K$ H) f9 `( o3 X
      661 tgcaaggcag agacccttgt gcaggcccga aagagaaagc ggacgagtat cgagaaccga+ A# B& b' j5 Q( R
      721 gtgagaggca acctggagag catgttcctg cagtgcccga agcccaccct gcagcaaatt5 M: G1 d' F* w8 d2 f5 z
      781 agccacatcg cccagcagct cgggctggag aaagacgtgg tccgagtgtg gttttgcaac+ A% b: ^- `7 g; `2 m
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      961 ggtaccccag gctacggggg gcctcacttc actactctgt actcttcggt cccattccct
" g7 l6 ]2 P- ?: E) x$ N# |     1021 gagggtgagg tctttccctc ggtgtctgtc accgctctgg gctcccctat gcatgcaaac
2 t9 O3 R& G! Q     1081 tga
4 q/ N: k6 q+ {& E//
& I* {' S9 U7 Q: R# q4 U" e引物" c( [( W: a9 s1 d
sense:  5’- GTCCG GATCC  ATT ATGGCGGGAC ACCTCG CTT -3’
& f+ L7 O" M8 g. t8 h" M0 v+ \9 z+ O. B$ J  O
antisense:  5’- GTTAT CTCGAG TCA AGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTA 0 v: w1 ]8 x1 n
GTTTGCATGCATAGGGGAGCC -3’
9 N$ D! @( a& m: V, Y# p2 p引物是加入酶切位点的& R7 h) ]( P3 x3 r
6.图片是一个拖带的形状，阳性克隆有条带。

lcxlorna

主要取决于你的模板和引物，延长退火温度不会有什么改善，你的目的条带是完全没有还是量小？有没有杂带？如果有杂带，说明组分没问题（没忘加东西），增加循环次数可能会有点作用，可能是你的引物不理想或模板质量不好。

鹤顶宏

具体我也太清楚延长退火时间的作用是什么，我当初扩2K的条带是也是不出与目的带大小相符的条带，我试着增加退火时间以后就能看得见了，当然其他的条带也是有出现的，另外按你这种情况，单靠增加循环数也不太可能出现的。

nankou2008

增加循环次数也不难 你试一次不就知道了 & F' M# N+ |) \& R$ B# k7 n
个人觉得延长退火时间不会有作用
/ ]; Y5 Q0 a# y% H& j: T/ r我觉得引物最重要 是用的现成的引物 还是自己设计的
3 w  N2 }( Z5 Y& }' q如果是自己设计的 还需要多做些摸索 评价吧

刘艳85

你可以试着再设计引物，尽量使其符合引物的相关标准，然后再试试。你的延伸温度是多少啊？这个温度你也可以试着调整一下

linzi214

GC含量高的话，可以尝试Takara公司专门针对富含GC的PCR buffer。自己设计的引物要考虑引物行不行的问题，另外，片段大、GC含量高的话，可以将PCR条件设为两段：第一阶段扩增温度低增加模板的含量，第二阶段再增大温度增加产物的特异性。还不行的话，可以在中间再设一个引物分段PCR扩增产物，最后再把产物产物出来后用PCR缝合在在一起。