PCR中，延长退火时间和增加退火的循环次数有什么区别吗？

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请教一下各位老师师兄师姐。) m+ G9 F7 t( ]$ s; R/ a3 G" O
在实验中，要P一段2000+bp的模版，退火温度降到42℃，还是P不出来。* U6 {. f$ K6 ~, o0 t* A, v5 \- E
我想延长退火的时间，但师兄说只有加多循环才可以实现量的提高，我想这两点不都一样吗？还望各位指教。

ying

退火时间延长是没有意义的。一般而言30s的时间充分且必要。循环数在特定前提之下确实可以提高产量，但看你说的这种情况，不像是能提高循环数就能做出来的。0 [+ _$ |( p. ?
几个关键信息，如果你不告诉大家，大家无法帮你分析：2 d$ O  ^) H5 G# u
1，模板是cDNA吗？还是基因组？还是细胞或组织？
5 F% c4 q1 a7 v3 P2，模板的GC含量如何？
) W. O  B; Q. S2 _0 L' I! D3，你用的是什么公司的什么酶？至少要告诉我是普通的Taq还是KOD之类的高保真酶？% ?; F# h: `+ o5 q: [) ^
4，你现在的反应条件。你现在PCR圈是数是多少？延伸反应时间是多少？
% p8 P" O( k) U$ d% I: Q5，你最好把你的2000多bp的序列贴出来，（不仅要包括目的序列本身，还要告诉我们目的序列之前和之后各100以上bp的序列），再把你的引物序列贴出来，大家可以帮你看看引物是不是有问题。你设计引物时设计的Tm值是多少度？, _" Y1 \6 K, J! g" U, `7 N5 f8 c, B1 A
6，你所谓P不出来，是完全没有任何条带吗？还是没有P出来目的条带，但是有其它大小的条带？还是是一个拖带的形状？你最好把胶图贴出来，便于大家分析。你确定不是PCR体系本身的原因吗？有带一个阳性对照吗（就是你实验室其他的人曾经P出来的序列，你使用他们的引物和模板，确实能够P出来他们所P出来的序列，但是同时做的实验里面你自己的PCR没有P出来）？

flashlab

有没有设计中间引物呢？延长退火时间你想达到什么目的呢？担心引物没办法结合到模板上吗？试试提高引物的用量

不倒翁

当然不一样了 退火一次只能延伸一次 增加退货时间也没有用的 引物就那么长 一般都用30s就够了 增加退货的次数就相当于增加循环数了 这样产物才可以变多  GC含量怎么样 高的话可以加点DMSO 《=5%就可以

冷血粒粒

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% _2 D! G9 H/ B0 ?2 w7 d) o( ^: Y
' h* T! g' L& B1 o' d" v- }, l我也有同样的疑问：: W7 u! \1 t$ H. E
1.我的模板是CDNA
! F4 t3 k, b+ D2.GC含量62.1%: z" q* j! V7 b# E6 N
3.用的是takara家高保真酶 primestar HS DNA polymerase
' p- K6 E/ l5 W. Y7 d* C4.现在的条件是touchdown 程序，从65°递减到55°，循环35个，延伸是2min
; b* T+ _$ c4 d$ L: c; s7 m* i  L, v5. 序列1 atggcgggac acctcgcttc tgacttcgcc ttctcgcccc cgccgggcgg tggaggcgat
! e0 t9 N. ?8 L$ [) ?& T1 x       61 gggccgggag ggccagagcc gggctgggtt gatcctcgga cctggatgag cttccaaggg: }4 m0 Z" ^4 W& T3 F
      121 cctcccggtg ggtcggggat cgggccgggg gttgtgcctg gcgccgaggt gtgggggctt0 `( u7 R7 S7 ^2 n( a5 }& h" d9 d
      181 cccccgtgcc ccccgcccta tgacttgtgt ggagggatgg cctactgtgc gccgcaggtt) u! z3 |1 k% T4 Y7 t. M
      241 ggagtggggc cggtgccccc aggcggcctg gagacccctc agcccgaggg cgaggcggga
: a' b! H4 M) ^$ D      301 gccggggtgg agagcaactc cgagggggcc tccccggacc cctgcgccgc acccgcaggc* n6 z5 S2 R: Y2 N7 g1 j- |
      361 gccccgaagc tggacaagga gaagctggag ccgaaccctg aggagtccca ggacatcaaa
' l/ h: T5 R8 E7 V: Y% ]7 D      421 gctcttcaga aagaccttga acaatttgcc aagctcctaa agcagaagag gatcacacta( S: E# K5 L3 y/ A; _* h- b* G! ~. p
      481 ggatataccc aggccgatgt ggggctcacc ctgggggttc tctttggaaa ggtgttcagc
$ H' L: v0 r/ ~  R      541 caaacgacta tctgccgttt tgaggctttg cagctcagtt tcaagaacat gtgtaagctg7 F; K; U$ G7 E, B, F
      601 cggcccctgc tgcagaagtg ggtggaggaa gctgacaaca acgagaatct gcaggagata
# O% d( P$ s* {  p! g      661 tgcaaggcag agacccttgt gcaggcccga aagagaaagc ggacgagtat cgagaaccga
/ T% ]2 m. X- `! w/ E      721 gtgagaggca acctggagag catgttcctg cagtgcccga agcccaccct gcagcaaatt
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      961 ggtaccccag gctacggggg gcctcacttc actactctgt actcttcggt cccattccct+ b  e* ?( Y- c/ a! m( r4 i5 B
     1021 gagggtgagg tctttccctc ggtgtctgtc accgctctgg gctcccctat gcatgcaaac& W5 m2 ^; W8 t# f2 z
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引物+ {, z4 I* N$ P0 r' W  K
sense:  5’- GTCCG GATCC  ATT ATGGCGGGAC ACCTCG CTT -3’8 z. b& t2 }" Z" L  Z: |! Q, P

' x. c# B( S3 b. u/ Dantisense:  5’- GTTAT CTCGAG TCA AGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTA
$ g7 P3 [0 p0 }% P2 pGTTTGCATGCATAGGGGAGCC -3’
% n4 g. L7 b' e4 W5 A% }! N引物是加入酶切位点的
/ i6 L: B" H1 F/ @) f$ r6.图片是一个拖带的形状，阳性克隆有条带。

lcxlorna

主要取决于你的模板和引物，延长退火温度不会有什么改善，你的目的条带是完全没有还是量小？有没有杂带？如果有杂带，说明组分没问题（没忘加东西），增加循环次数可能会有点作用，可能是你的引物不理想或模板质量不好。

鹤顶宏

具体我也太清楚延长退火时间的作用是什么，我当初扩2K的条带是也是不出与目的带大小相符的条带，我试着增加退火时间以后就能看得见了，当然其他的条带也是有出现的，另外按你这种情况，单靠增加循环数也不太可能出现的。

nankou2008

增加循环次数也不难 你试一次不就知道了
- r! \- G/ ~7 a个人觉得延长退火时间不会有作用
0 I# ^/ p: g5 z7 B/ S我觉得引物最重要 是用的现成的引物 还是自己设计的) R) N" {  A* h/ N9 d* k8 b
如果是自己设计的 还需要多做些摸索 评价吧

刘艳85

你可以试着再设计引物，尽量使其符合引物的相关标准，然后再试试。你的延伸温度是多少啊？这个温度你也可以试着调整一下

linzi214

GC含量高的话，可以尝试Takara公司专门针对富含GC的PCR buffer。自己设计的引物要考虑引物行不行的问题，另外，片段大、GC含量高的话，可以将PCR条件设为两段：第一阶段扩增温度低增加模板的含量，第二阶段再增大温度增加产物的特异性。还不行的话，可以在中间再设一个引物分段PCR扩增产物，最后再把产物产物出来后用PCR缝合在在一起。