高手请进！脐带间充质干细胞组织块法分离失败。第3-5天组织块间很多膜状沉积，求解...

quge_00

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# x2 M/ z) v: g" `' {3 G7 c+ y谁能帮看看我的实验步骤：3-5cm的wharton胶养一个60mm的培养皿。" M! W* o6 J3 Z
1、无菌收集脐带，浸没于含1%双抗（青链霉素）的4℃预冷PBS中，清洗表面血污；
9 F# J. G2 I% G/ |1 i$ _) u2、灭菌棉线结扎脐带一端（1cm处），另一端固定于超净台，将脐带浸入4℃含双抗PBS的灭菌容器中；# M( ]; s- O* C4 ^
3、超净台内用手术刀片环切距线结端约0.5cm处脐带外膜（勿环切过深），用皮钳将脐带外膜整张钝性剥去；止血钳钝性剥离2根动脉和1根静脉；
: G9 r! H8 V& O+ L4、距线结端约0.5cm处切断血管和华通氏胶，再次用含双抗冷的PBS洗净血污。将华通氏胶剪碎至约1mm3，转移到50ml离心管，用PBS以1000rpm两次洗去粘液；
3 A$ a- t7 L8 s( `* ]4 h5、将组织块转移到细胞培养皿中，使组织块分散平铺在培养皿上，间距为5mm，入37℃、5%CO2孵箱培养30-40分钟使组织块贴壁；   O0 Z' l4 p9 S% r9 y. @. ?
6、加入DMEM/F12培养基（含10% FBS）6ml后，入37℃、5%CO2孵箱培养，5天后半量换液。

quge_00

养3-5天，组织块间就开始有一层膜状物，没有细胞结构，像是死细胞或者是蛋白沉积，一晃动就能剥落下来一层。但是总是很多，显得很脏（换培养液是感觉很粘稠，像胶水一样）。已经养了4批了，只有一个培养皿像是MSC，但是可喜的是还没传代就莫名其妙的死掉了。。。) t6 `4 i: }$ m( N1 i) o
换过FBS，培养液需要换a-MEM吗？
, r1 }* c2 s0 W9 V; r  X, _

quge_00

4 W  t9 ~& L9 c* R9 A
6 i' l5 j! L2 D: x2 t3 H: T底面观

quge_00

正面观

quge_00

现在问题是这层膜怎样处理呢，挂掉害怕组织块松动；留着的话细胞是不是没地方长了？
( b  R- G- l  X- J最要紧的事显微镜已经很难透光了。。。。。。
9 w; _$ y4 ]; q! O+ h8 @高手速来，$ I7 [$ p. ~/ V& o( h
感激不尽啊。。。

xxuudd

怎么会有膜呢？是污染了吧？
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单个核细胞

$ J$ s7 C9 {& |% [: P, [- z
5 D; [* ^9 ~* }% ^/ [2 L1 _  ^
回复 quge_00 的帖子  N+ g$ o) E  z- u+ d
  T- g' |# x6 P6 F
推测为污染，建议重做。
( h# ~/ n4 U- m3 l7 u  n: I% y. B: M( K+ R& q  _9 v4 D
你可以这样试一下，不要剥外膜，先将脐带剪成小段，然后组织镊剔除动静脉，直接剪碎，贴壁5小时后加入完全培养液，静置培养。. [( ?8 U3 M* |0 u

3 V6 I- Q- ^3 ^) N5 A% ], v1 ]熟练之后再行脐带华通胶组织块贴壁培养。

sdwzg119

8 g# q: V5 Z# d# l  e, w; E& Q$ f+ v( q
- E- @+ I2 [8 @回复 quge_00 的帖子) V) l4 `0 M& k. v
) Q% l7 Y/ h1 y/ q0 u
不会有膜的，我认为你这是污染了，现在组织块贴壁法样脐带MSC挺成熟的。$ V& a# _1 b2 @# \, ^2 N, R
你描述的3-5天有白膜长出，这个时间正是细菌生长出的时间，你连续四次都这样，说明你无菌处理的非常不到位。% c5 ?, O' f- h: f3 p% u' s" a

- I" `8 ^- p' G) K$ t2 R脐带，你光指望双抗水是不行的，它可能有非常多的真菌，我建议你多冲洗一下，起码冲洗10遍以上，去脐带的两头。

quge_00

回复 xxuudd 的帖子7 w0 p# Z# Z# z/ Q
7 `; N( f+ T- y2 y: q  y( B
谢谢！最近整个培养箱都出问题了，污染也非常可能。。。

quge_00

回复 单个核细胞 的帖子$ n, |, J& n6 M3 H8 f! R) h0 e

2 i$ P  F; _( O1 t$ Z6 H非常感谢~~~最近整个培养箱都出问题了，我想也很有可能污染（还有几次长出霉菌菌落）。。。弱弱的问一下：粉碎后静置5小时不怕组织块干掉吗。。。。？？