高手请进！脐带间充质干细胞组织块法分离失败。第3-5天组织块间很多膜状沉积，求解...

quge_00

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谁能帮看看我的实验步骤：3-5cm的wharton胶养一个60mm的培养皿。0 T7 E! F2 h9 p' z
1、无菌收集脐带，浸没于含1%双抗（青链霉素）的4℃预冷PBS中，清洗表面血污；
* q$ K" J5 a( L3 n+ Y2、灭菌棉线结扎脐带一端（1cm处），另一端固定于超净台，将脐带浸入4℃含双抗PBS的灭菌容器中；
; z3 P6 q. |: L, S5 ~# C9 `4 H# @  G$ s3、超净台内用手术刀片环切距线结端约0.5cm处脐带外膜（勿环切过深），用皮钳将脐带外膜整张钝性剥去；止血钳钝性剥离2根动脉和1根静脉；
( ~* w9 l( j9 H* m  r0 K4、距线结端约0.5cm处切断血管和华通氏胶，再次用含双抗冷的PBS洗净血污。将华通氏胶剪碎至约1mm3，转移到50ml离心管，用PBS以1000rpm两次洗去粘液；
7 h/ `* l* c1 L: w' p6 ]5 y5、将组织块转移到细胞培养皿中，使组织块分散平铺在培养皿上，间距为5mm，入37℃、5%CO2孵箱培养30-40分钟使组织块贴壁； # R8 N# s) L5 V( V4 I( w& o+ H
6、加入DMEM/F12培养基（含10% FBS）6ml后，入37℃、5%CO2孵箱培养，5天后半量换液。

quge_00

养3-5天，组织块间就开始有一层膜状物，没有细胞结构，像是死细胞或者是蛋白沉积，一晃动就能剥落下来一层。但是总是很多，显得很脏（换培养液是感觉很粘稠，像胶水一样）。已经养了4批了，只有一个培养皿像是MSC，但是可喜的是还没传代就莫名其妙的死掉了。。。
" U' S. o3 `, c# ]7 `换过FBS，培养液需要换a-MEM吗？7 `8 A' b! u- z) [0 c% M+ z

quge_00

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底面观

quge_00

正面观

quge_00

现在问题是这层膜怎样处理呢，挂掉害怕组织块松动；留着的话细胞是不是没地方长了？
7 m/ T& \6 i  x$ L! R最要紧的事显微镜已经很难透光了。。。。。。7 I" _1 c+ c5 |6 z2 Q
高手速来，6 j5 p8 E+ ?, B& J) }, ~3 c
感激不尽啊。。。

xxuudd

怎么会有膜呢？是污染了吧？
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单个核细胞

  z% X1 v' P1 Z/ p/ R" s
; l; [2 F4 |  W1 U4 F* a
回复 quge_00 的帖子6 y. p9 S2 A6 {

5 D; o0 L3 n9 V) p( B推测为污染，建议重做。( d5 B  @+ c  z& x6 I

& n) m- p. G3 e! K8 {7 J  A你可以这样试一下，不要剥外膜，先将脐带剪成小段，然后组织镊剔除动静脉，直接剪碎，贴壁5小时后加入完全培养液，静置培养。) ^/ x3 ^) a3 Q- e  r) m

# j$ [) L3 R+ ]; M: Q熟练之后再行脐带华通胶组织块贴壁培养。

sdwzg119

' K5 Q1 G4 p4 ]: m7 Q- o, F/ w9 Q* X. v# Z- L( ~1 n
回复 quge_00 的帖子4 w. ~! X8 L5 v5 \7 }

7 n" L: |- F! T不会有膜的，我认为你这是污染了，现在组织块贴壁法样脐带MSC挺成熟的。
  F7 K3 m8 U+ `' q( R4 M; g; {你描述的3-5天有白膜长出，这个时间正是细菌生长出的时间，你连续四次都这样，说明你无菌处理的非常不到位。
0 [9 Z8 H% n, G( \6 K- q0 ?2 y# \! W9 D1 d5 N' a3 q6 ^  L
脐带，你光指望双抗水是不行的，它可能有非常多的真菌，我建议你多冲洗一下，起码冲洗10遍以上，去脐带的两头。

quge_00

回复 xxuudd 的帖子: B0 A/ i+ d# g4 Q

( E; b8 F; T' l' N$ F谢谢！最近整个培养箱都出问题了，污染也非常可能。。。

quge_00

回复 单个核细胞 的帖子3 Z2 @9 I1 E; ~, ?4 X

# y3 ^2 ^# P8 {5 Z7 H8 a* r5 }非常感谢~~~最近整个培养箱都出问题了，我想也很有可能污染（还有几次长出霉菌菌落）。。。弱弱的问一下：粉碎后静置5小时不怕组织块干掉吗。。。。？？