高手请进！脐带间充质干细胞组织块法分离失败。第3-5天组织块间很多膜状沉积，求解...

quge_00

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* b& O& l7 Z8 j( H  O+ C5 K谁能帮看看我的实验步骤：3-5cm的wharton胶养一个60mm的培养皿。9 s  R: x0 G( O: s7 Z5 x; K2 j
1、无菌收集脐带，浸没于含1%双抗（青链霉素）的4℃预冷PBS中，清洗表面血污； $ U( d1 f# i. f1 }: H
2、灭菌棉线结扎脐带一端（1cm处），另一端固定于超净台，将脐带浸入4℃含双抗PBS的灭菌容器中；4 j8 y" E) m" P5 {  T+ ~- V  `
3、超净台内用手术刀片环切距线结端约0.5cm处脐带外膜（勿环切过深），用皮钳将脐带外膜整张钝性剥去；止血钳钝性剥离2根动脉和1根静脉；: l  ~0 W! A) G3 D
4、距线结端约0.5cm处切断血管和华通氏胶，再次用含双抗冷的PBS洗净血污。将华通氏胶剪碎至约1mm3，转移到50ml离心管，用PBS以1000rpm两次洗去粘液；
- x  q3 V6 [) n$ G5、将组织块转移到细胞培养皿中，使组织块分散平铺在培养皿上，间距为5mm，入37℃、5%CO2孵箱培养30-40分钟使组织块贴壁；
/ H6 x: ~* e1 D6、加入DMEM/F12培养基（含10% FBS）6ml后，入37℃、5%CO2孵箱培养，5天后半量换液。

quge_00

养3-5天，组织块间就开始有一层膜状物，没有细胞结构，像是死细胞或者是蛋白沉积，一晃动就能剥落下来一层。但是总是很多，显得很脏（换培养液是感觉很粘稠，像胶水一样）。已经养了4批了，只有一个培养皿像是MSC，但是可喜的是还没传代就莫名其妙的死掉了。。。
, H3 X0 v' j% t7 }9 \换过FBS，培养液需要换a-MEM吗？' E& a  _+ E$ H: j: x$ g

quge_00

( {, j7 }& {, x9 G

# z$ V' P, G' w. A$ g4 S底面观

quge_00

正面观

quge_00

现在问题是这层膜怎样处理呢，挂掉害怕组织块松动；留着的话细胞是不是没地方长了？& k# a% h3 Y9 \% E6 V$ G
最要紧的事显微镜已经很难透光了。。。。。。% |8 V/ E1 y3 n' K( N
高手速来，
: [4 D5 f: R5 t9 `2 v$ [* I* P感激不尽啊。。。

xxuudd

怎么会有膜呢？是污染了吧？
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单个核细胞

4 P8 I8 x. D  D+ b% ]# b$ K
5 R- }( p% S) x+ w回复 quge_00 的帖子
2 {2 ~: \+ y1 P: m! ]6 N5 j$ c8 g/ r- e  X4 J( r
推测为污染，建议重做。
: i% H6 I' m  l0 y7 U# U, i* ]: p! c% _2 i1 J) ]4 p
你可以这样试一下，不要剥外膜，先将脐带剪成小段，然后组织镊剔除动静脉，直接剪碎，贴壁5小时后加入完全培养液，静置培养。
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+ t+ I- C3 w! G$ U5 L* S熟练之后再行脐带华通胶组织块贴壁培养。

sdwzg119

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; l$ t% y! M, N- J$ F回复 quge_00 的帖子% @1 `0 D! K3 A0 U

5 t( w7 Q7 @' h不会有膜的，我认为你这是污染了，现在组织块贴壁法样脐带MSC挺成熟的。
" E8 K/ S4 f7 F9 F你描述的3-5天有白膜长出，这个时间正是细菌生长出的时间，你连续四次都这样，说明你无菌处理的非常不到位。
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! ^* X# J1 G: o/ f; r脐带，你光指望双抗水是不行的，它可能有非常多的真菌，我建议你多冲洗一下，起码冲洗10遍以上，去脐带的两头。

quge_00

回复 xxuudd 的帖子
5 E+ A3 M2 L" j: |" ^6 _9 s1 l& h/ ?; }/ i$ b+ u0 [  {$ m7 c
谢谢！最近整个培养箱都出问题了，污染也非常可能。。。

quge_00

回复 单个核细胞 的帖子, {% @3 d# s2 ~1 i. d$ Y; s

/ b& @4 }( i1 k  B/ p非常感谢~~~最近整个培养箱都出问题了，我想也很有可能污染（还有几次长出霉菌菌落）。。。弱弱的问一下：粉碎后静置5小时不怕组织块干掉吗。。。。？？