怎么通过基因表达来检测细胞凋亡？Fas和Bcl2，bax，BclX能不能检测？

jiojoo

# v0 y9 q1 ~4 A
! C8 P1 r  P; d因为样品已经没有了，只是还有cDNA样品，想顺便检测下细胞的凋亡情况，所以就定了几条引物跑了个qPCR
$ N5 l  x  E6 D结果如下图
/ k* n+ n2 y" F. n9 `; e. P8 r6 kB组是对照，三个处理组，分别是D组、F组和H组，3d和5d两个时间点
8 D9 N; h2 a+ R6 c$ E- s

2012-7-17 23:37 上传

下载附件 (96 KB)

; l7 G" G. J; G! {/ N这张图片能不能说明一些凋亡情况的？* R" K0 H8 A. n8 B* R0 r
或者需要做哪些基因才比较好？% I8 |! @9 S/ [- L6 D2 y
期待大侠的意见，非常感谢！

yuhaoze

Fas是受体吗？ CD95R？
$ L' z' j( P! u5 E+ x我看其他三种都是信号通路下游的一些凋亡因子，可不可以检测caspase呢？$ x# u4 l" h+ i3 o7 e2 l# x( j
不知道你研究的是那一块儿，但要是想检测凋亡的话，通常情况下是western检测活性的caspase8/10/3/9等等& y( t9 U4 E) N2 [- m/ K

希望之光

凋亡相关的基因有很多，首先你选择的这几个是不是和你的实验目的相关，单凭图中的数据来讲，并未发生凋亡，或者说个别的根本就没凋亡。再看看相对表达量也不高所以呢建议楼主再仔细琢磨一下

妖妖空

我们可以好好交流一下的，我最近在做的是过氧化氢诱导的HL-60细胞的细胞凋亡的实验，也是第一次做这方面的实验，昨天96孔的板刚刚给药，今天先大致检查一下细胞形态，做下荧光染色，看下凋亡小体等的情况，做个DNA电泳，看下DNALadder。最后检测一些较明显凋亡细胞的细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸（ps）的含量，请问这样做初步筛选来确定能引起凋亡的浓度范围，行不行。谢谢指导。

妖妖空

回复 yuhaoze 的帖子
# y/ u. ?  @' X7 z& {; `# z3 m
# _. q) k( ^. ?1 M# _! F一般检测caspase的时候，起始caspase和效应caspase都要检测吗？通过特殊的caspase检测能确定凋亡是内源途径还是外源途径吗？

妖妖空

回复 yuhaoze 的帖子" s$ E$ H& i! f
- R4 `& D" p& w* B9 h% ?
Fas是外源途径中的受体，它的配体是Fasl。Bcl2家族对凋亡有抑制作用，其他两个蛋白家族对凋亡都是促进作用。

yuhaoze

8 y4 l7 h- B9 }" H4 X# U" {" V% A
- G3 ]" g  A- ~检测那三个是一个anti两个pro，如果检测受体的话你就默认了那是fas外源性通路，但是外源性通路受体至少有4个。我这里有三个想法：
4 `* z6 Y# L0 P7 D; ?* m3 o+ g- }  T1.这个要看哪个快，一般如果在凋亡一开始就能检测到大量活性的caspase8/10，而细胞色素C和caspase3滞后的话，那很可能就是外源性途径。通常的作法也就是检测3个 caspase 8、10、3， 再多了也没有意义。  h# m. A( m; h! g
2.个人认为（因为有将近1年内有看这方面文献了），外源性通路和内源性通路的差别在于，capsase3和capsase8/10, 哪个是上游，哪个是下游。如果激活外源性通路，capsase3是下游，如果内源性通路caspase8是下游，我只是说一般情况，现在研究出了capsase12通路等等，就不在这个探讨的范围之内了。
& w- B! U  P9 e( d5 @8 }根据这个判断，你可以用特异性的capsase抑制剂，来抑制其中一个，看看另一个的激活状态是否改变。举个例子，如果你抑制了caspase8,发现caspase3从大量激活状态变成了没有火星的状态，那就可以证明caspase3是下游。
5 i9 I4 ]! K8 V, h0 v9 g/ U3.有一个连接受体和外源性起始caspase的蛋白,FADD,在各种外源性通路中都有参与，也可以检测这个。0 c3 n) Q/ x9 k/ Y4 a
) g# G8 v, u! i* K) M9 F8 b* y0 k3 W0 ]
1 L1 G: N; _. S9 W* y0 f/ `

7 e9 ?9 I: n% j- Q, `2 P. k我写过一个英文的东西，可以传给，你不知道会不会对你的想法有帮助

yuhaoze

检测磷脂酰丝氨酸这一步必须要做吗？我觉得很贵，而且你前面几步已经能够说明问题了，可以直接进入通路研究了

jiojoo

回复 yuhaoze 的帖子
0 M# \) M0 G9 e1 b* Z- G& x( N+ o5 P. J0 r5 c2 B+ F4 \9 n$ D' X2 ~
感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。
7 _+ G) V' ~8 W& s% s: o+ P0 c) t我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下- ]5 w5 O6 h1 \0 w% W5 o
Fas在NCBI上的描述是Mus musculus Fas (TNF receptor superfamily member 6) (Fas), transcript variant 1, mRNA/ E$ ^; D7 H6 J: X1 @6 u  F
NCBI Reference Sequence: NM_007987.27 a# Z/ @& b4 a0 y
6 ~& F! U' f4 [, K) I4 b/ s4 U( \
Bclx是Mus musculus BCL2-like 11 (apoptosis facilitator) (Bcl2l11), transcript variant 2, mRNA9 T2 ]- ?- T& [! x+ X: `
NCBI Reference Sequence: NM_207681.27 t- ?9 i+ q; C& ~8 h" N- n5 O7 Z! F

" Z* V. t  x2 a$ w0 j) x0 wBcl2是Mus musculus B cell leukemia/lymphoma 2 (Bcl2), transcript variant 2, mRNA
' w$ ~& o& O# a  a( MNCBI Reference Sequence: NM_177410.21 L8 d0 L5 K) \
# H/ U5 I( L; L# Y( H" n; k# t7 }
Bax是Mus musculus BCL2-associated X protein (Bax), mRNA: D7 l5 N$ s; R2 p& E2 n$ S) n$ ~
NCBI Reference Sequence: NM_007527.3: A6 `7 k2 [- M8 b

1 i* ?& ~9 j: E3 C另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~
5 [5 [; ?% O0 e5 ?2 W所以，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？
) @; C+ E# N, K6 f" H& y" }" L

jiojoo

回复 希望之光 的帖子
  k: N: T1 y. a' L- Y  j9 h% C+ z/ ~8 E! s9 I
感谢回复，因为我并不是做凋亡这一块的，凋亡相关的东东完全不懂。
) d& C. P! @0 L我只是看到其中一个组细胞7d之后都死光了，所以就想看下是因为坏死还是凋亡，另外，因为现在的样品还有cDNA，所以就只是想做个初步的实验来大概地判断一下
& A7 R) r' Y6 ^3 ~另外，图中Bclx和Bax标反了，不好意思~& W4 Q0 D1 m+ ?+ h+ [) T* O
另外，您能否提供一些更好的基因来检测是否有凋亡的迹象呢？% T# c2 F5 |9 g" Y5 y