关于mES N2B27 feeder-free serum-free培养

vegetax4132

$ g& X# M- ]! I
2 W" F$ t/ L9 M2 M9 z: n
最近想建立mES的 feeder-free serum-free的培养体系+ R2 S2 `5 }5 O* q+ |- f
结果发现细胞传入N2B27培养基中大量不贴壁。但克隆球都是活的，再移到feeder上也都能长起来。5 G: C6 J% B$ Q% b
大家有遇到过这种问题吗？
, \! l0 K" h* \% E  ~
$ j$ W1 y; u0 [) J5 N我用的培养基:
2 D2 ~$ v# I# R, n: z" |$ ?N2B27+LIF+2I+β-巯基乙醇+Glutamax+双抗      - [+ b! f* X; u  W5 J* k) h: e
看YING QL 06年的那篇protocol中没加非必须氨基酸和丙酮酸钠，我也就没加。
6 |4 Q4 `( y- N+ {5 Y1 x. a, Y7 V6 z
在N2B27中， 图中圆圆的小球基本都没贴壁：
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2012-8-8 21:45 上传

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, g  X' Z8 S& J$ q将图中小球移入feeder  血清中，就都贴壁了：3 t! n* f6 p, Y5 p5 {

2012-8-8 21:41 上传

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labghost

回复 zmm 的帖子# K9 ?, d4 }  {9 t- Y, }) m
* X# l  ^9 A% W' X& z. r
这血清有没有谁试过用HSA代替呢？

sunnyhuan0629

如果真的是feeder-free的培养的话，建议先铺一层matrigel的，这样克隆团才会贴壁生长。另外，培养基的话，我们使用mTeSR1和PSGro都没有问题的啊~

坏蛋蛋阿布

用无血清培养加血清铺皿会不会有很多血清中不知明的东西上去了，有没有试过gelatin铺皿过夜

vegetax4132

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. v6 I; z1 C" ]
# S, _8 z! L: X% k, y" J十分感谢，我最近也把NEAA加上了，我发现用100%的FBS包被板子效果很好。

wbj1983

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, T; u7 {- C0 @, ^0 M& H
% w  Y) \, y' W6 j8 p2 v$ A; V“N2B27+LIF+2I+β-巯基乙醇+Glutamax+双抗”这个培养基是没问题，试着可以加一下NEAA，我是这么做的。还有培养皿一定选择贴壁效果最好的那种corning的（这也是我自己用的）。铺0.1%的明胶37℃20-30min，我们培养的贴壁效果挺好，根本不用需要matrigel，matrigel相对来说还是很贵的。还有希望您尽量用进口的ES medium所有组分，国产的在这方面还是欠佳（不过我觉得您也肯定用的进口的）。还有，您冻存ES的时候可以用90%FBS+10%DMSO效果可能会好一些。纯属个人建议，我是这么做的效果不错，来这儿和大家分享一下，希望对你们的实验有所帮助！

zpzp0312

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( E# i" }; ]7 q
# }: n+ ]& P$ z8 E我回帖的主要意思是matrigel不一定适合细胞贴壁
3 D1 X  K3 z' F' ^  e, h7 c虽然有这样的报道
: G4 y* I0 E- m. `! Y毕竟matrigel比较贵，如果有其他解决方法就没必要花那么多钱买matrigel去试验

zmm

回复 vegetax4132 的帖子$ t) u9 E  B8 @* Q9 u8 f

8 c3 X. w7 v/ ~) ^1 V血清也可以。因为不含血清，所以克隆增殖较慢

vegetax4132

回复 zpzp0312 的帖子
( G) n& Q! S. E3 P, W; B5 |, v" _( P: g0 A, t3 u
谢谢，    不过ESGRO也是一种类似N2B27的培养基吗？      
" k( d0 t& C! x+ @$ w0 K我用N2B27+LIF 加上feeder，  发现克隆形态不好，feeder有大量死亡   

vegetax4132

回复 zmm 的帖子2 Q5 w4 h7 J9 J1 b1 ^$ U" Q
3 v" l2 f5 I- a" A3 Z/ c- ]
我是铺了明胶的，  u: R# |: R& a8 ^- _. r
最近听说再铺一层血清就能贴壁了，试了下真的基本都贴了，不过这样克隆长的很慢了。好几天天都不见长大。。。