有养过RAW264.7的高手吗？

一转身的距离

如题，请教，为什么细胞冻存后复苏不贴壁？是不是RAW264.7对胰酶的作用很敏感？但是为什么在培养时又会觉得很难消化？
; x( Y6 n6 `5 [5 V/ L4 |' |才养这株细胞，急求解答！

一转身的距离

4 D7 P1 p, M  Z( I3 ~. T$ D1 _/ K
6 `/ E6 V$ v9 {1 q0 {回复 katysong 的帖子) z* C/ I/ f% ~- R4 K* Z; ^: y. B

" l( m! N0 y/ b* K我们原代培养的是腹腔来源的~

myboluo

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! R6 f0 U# X6 E% z5 {' z
' p1 r8 N7 B. X* W我们也是两个小时贴壁，不过这时候还贴不牢，一吹一晃就掉了，要想贴的牢就需要7天左右

eley

强烈建议不要用胰酶消化，Raw对胰酶非常敏感，而且很容易分化。0 Q4 o1 ~# ]9 S9 [5 P
还有就是在用之前的培养基一定要预热。( u( S+ e6 |6 T' r9 l
我使用的是1640，现在细胞长得很快. i  v6 w' A: ^) S1 N" D
每次传代的时候，用枪把细胞吹下来就好，不要消化。

katysong

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3 W( g# }' Y" r; p; U
; ]7 y$ |9 ?6 T6 |% \& t我们一般是用加EDTA的胰酶消化的，加酶之前用预热的PBS多洗几遍，至少两遍吧，然后加酶消化，一般3分钟以后细胞就可以变圆了（当然也要看你酶的活性，刚开启或融化的胰酶效力会好一些），可以再等一分钟，不要直接把细胞吹掉或拍掉，可以先吸掉胰酶后用PBS洗一遍，防止EDTA对细胞以后的贴壁有影响，1：2或1：3传代都可以，看你原来的细胞密度；
1 X; K# O8 |* {- n6 L) j复苏的话就只要注意快速融化，以防冰晶对细胞的影响，说难养其实还是挺好养的，要有信心，祝好运！

katysong

回复 myboluo 的帖子; [8 F; y7 X8 }  R+ h2 g& r) P5 _4 X

. @: g0 \9 r+ i, P/ Y7 o0 j3 O9 j; ]不知道你养的小鼠巨噬细胞是来源于哪里？骨髓还是腹腔？但两种巨噬细胞贴壁的话都不用太久，2小时后就开始贴壁了，当然我们一般是用过夜后再用的，不过确实增殖比较慢，除非加因子比如：M-CSF

andyz0922

我们的实验室都是 用PBS 吹打的  没有用胰酶消化的   RAW 很容易脱壁

一转身的距离

谢谢各位的建议与宝贵经验，很受启发！非常感谢！

shy8610

raw264.7相对来说，还是比较容易复苏的，要求是冻存株当时是健康优秀的，复苏的时候，尽量选用进口一次性耗材，包括管子和移液管，培养基单独配，不与其他细胞混用，PBS的要求一样，我们实验室十分介意raw细胞是否受刺激，消化情况也可以看出细胞的状态，一般来说，37度消化2分半，就可以镜下看出细胞变圆，然后可以用拍打的方式将细胞拍下，绝对比等着胰酶效果好，另外注意防污染黑胶虫

一转身的距离

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0 @' f- M, Q3 V) H# B7 g  T+ D7 E
6 @2 D& K1 L$ F没有试过用预冷PBS浸泡，因为它贴壁牢，所以没想过可以用这种方法。可以试一下。