ficoll淋巴分离液分析骨髓间充质干细胞

qiugt0819

，有明显的三层分层，但看不到传说中的狭窄白膜层，然后我在红白相间的地方抽取了约2ml液体（计数板每个视野约50个细胞），加pbs800转离心5min，弃上清，再细胞计数却发现没有几个细胞了。问题：没出现白膜层是否跟离心参数有关，加PBS离心是否因为2ml中有淋巴液，结果细胞又悬浮在上清液中被弃掉了呢，希望各位不吝赐教。

romanyuo

淋巴细胞分离液如果效果不好，可以进行全髓培养，利用贴壁培养进行筛选MSC

katysong

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: t! c/ \8 ?' ~' ^, d9 t+ o
2 g* J# I( K& [# L1. 建议稀释比例为: 小型猪骨髓：DEMEM：分离液=1：1：1
( K$ G) u/ c6 o; i2. 你在加入稀释液的时候，先把装有淋巴细胞分离液的管子倾斜到一定的角度（45度角差不多，或者角度可以再小一点）；然后再用加样枪加入稀释液（1毫升枪的冲力比较大，可以考虑用吸管或是将1毫升的枪头用无菌的剪刀剪去一小截，可以减缓冲力），小心加入后就可以形成临界面，之后再加起来就方便很多，第一下是最重要的！
- j" X$ U9 {' `3. 随后再配合前面说的转数(2000rpm)、温度(25摄氏度)和时间(20 min)，相信你肯定能成功的，祝好运！

jxaf3900824

水平离心，离心力800G就可以了

fenglinzhu

一般ficoll都是500G到700G，20到30min缓升缓降，尤其是减速度越慢越好啦。加样的时候可以用电动移液器5ml移液管，第一滴一定要加好，然后就会比较好加了。分离效果的好坏与细胞密度有关，但图片上看的话红细胞应该不多，所以应该不是细胞密度的关系。从图片上来看，没有明显的灰白层，分离效果相当差，如果分离效果好的话灰白层是很明显的。在这种情况下一般吸取红白层中间的那4ml（用15ml离心管），取2ml少了点。还有就是你才50个细胞，还用PBS洗一遍那细胞肯定就很少了的，离心得再好悬液中也会有很多细胞残留的。

wangzhiqi86

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/ B. p3 v6 K/ U/ P  A6 l
" @  e, q6 C6 p" z需要缓慢逐滴加入，越慢越好( U' Y. i1 I! V- S, N5 ?) g/ g) ]

crazytime

感觉标本量相对有点少，所以白膜层才会不明显

qiugt0819

回复 lxm5668 的帖子* T5 G  p6 P4 V7 e  a$ ~4 T2 ~

+ r  l  X$ f$ U8 {: r好的，谢谢，下周再试一次，希望能有好结果

lxm5668

1."稀释液用加样枪每毫升加到ficoll液上的",你这一步改成用移液器，选一个口粗的的巴斯德管，沿着管壁慢慢加到ficoll液上，管子稍微倾斜，加完后再垂直过来，操作要慢；: C+ Y7 k. e6 X+ E1 N
2.最后那部离心转速要加大到1500-2000rpm,时间也延长，单核细胞毕竟较小。
4 K$ B7 v" P6 `/ h3.骨髓冲洗过程再仔细点。试试。

qiugt0819

回复 wangzhiqi86 的帖子- ^$ a8 L1 b7 i9 N, X

0 O0 }: [$ f9 a稀释液用加样枪每毫升加到ficoll液上的，但还是感觉会混到一块