RNA电泳，求解

runsong

第一次做体外转录，加帽，没加尾。浓度1300ng/μl1 C' a  Y+ @- w$ q5 m' k
然后用1%的普通胶电泳。7 @1 \. @1 q7 p. c2 ^& q
根本木有注意电泳中RNA酶的问题，木有甲醛，啥都木有注意。
# Y( m1 ]- c5 E+ i跑成了这个弥散带
: G" h4 Q2 Y* |" o想问：
6 \+ F4 ]' m6 F4 y 1、标准的体外转录产物电泳加不加甲醛，是否用5%的胶影响大吗？
" X! M/ b& s& J1 \ 2、我的片段是不是降解了？是电泳过程中的，还是本身就降解了？
- m4 c9 O2 h2 s/ U$ g# c  F2 A; c# r1 F6 q$ H3 `: C
注：没有RNA marker，DNA marker 也没有，本人根据经验，产物大小若以DNA marker判断大概有1000-1500，我的目的片段应该是2000nt。

dianying

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. Z0 i4 o% r; y- E5 |$ w" }* x! n% f7 W. z( }; |
看起来像你的样品本身降解。

ying

质粒模板要酶切线性化之后用蛋白酶K消化，酚抽，乙醇沉淀。转录时一定要加RNAse抑制剂RNAsin。全程要无RNAse。
  _# \, n. y& M2 V我觉得你这是转录时有污染。是不是没有加RNAsin啊？一般不会是跑胶的时候坏的。+ X  l$ I% O' Q
我做的按你这一样的条件跑胶会是一条或两条带（两条带可能是非变性的情况下有二级结构），都是好的。
! Q9 x- _1 K# Q

runsong

我将质粒模板酶切线性化之后用的，之后胶回收。
% E5 Q- E0 y1 c: N/ l( `4 c5 Q盒子用的mMESSAGE mMACHINE Kit，里面有RNA酶抑制剂。1 C* |# o( _* {+ ?( `0 h7 c
你的意思是我的样品RNA酶污染了吗？

weiyepan

RNA电泳跑1~3%琼脂糖TE电泳本身是没问题，问题是如果你用的是平时跑质粒的电泳槽和buffer的话，里面本身就很多Rnase（miniprep kit里面带的）。所以，想偷懒不做甲醛电泳的话，最好跑之前把槽洗干净，新胶换新的buffer跑。1 Y6 ^: j# @* B6 F# V, R
另外RNA是单链有2级结构的，如果不做变性电泳，是看不出准确大小的，而且本身RNA和DNA糖环分子量大小也不一样，我不知道你连marker都没点怎么样看出大小的。。。
, Q0 g) a, d0 P

ying

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$ \# |- U, a6 U
2 [+ ^" _7 A2 g, t8 Z# z* U' }& v我个人觉得像。MMkit里面有阳性对照质粒的，你可以按照上面的trouble shooting做一下嘛。带上pos.ctr  o. E* t( x, P. h
我质粒线性化之后是要做PK消化和酚抽乙醇沉淀的。RNAsin只能干掉少量的RNAse，要是RNAse残留太多还是不行的。一般实验室RNAse主要来源就是小抽，你的枪最好洗一下。

细胞海洋

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4 O" i4 J3 I+ X- `, h2 c2 Q$ F% _7 O# s2 o$ B% \
你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮 然后输入内容 像我这样
- E! B% W* L; ]/ A% s8 R2 \# ^7 K% X8 i9 o
否则他会看不到

huangxf1998

你的应该是做出来了。' S6 V% u: z2 ~5 O4 r( E* ?
只是你的照相水平有待提高，对焦啊！
& o, S- ^# r( S" j( J0 s% t- T9 C' O: u3 R. w
但是，侥幸跑出来不等于以后也会跑出来。楼上同行的话应该好好记住呀！