DC细胞的培养方案和流式检测？

hwlightning

1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。
; x8 I. a$ Q/ A6 f6 o2 W' x' Z2、将外周血单个核细胞在铺在培养瓶中，用加入25 mL免疫细胞无血清培养基
$ L. M5 V& U' W) _3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时, T4 f* h0 z6 c/ J
4、弃掉含非贴壁细胞的培养基4 M0 v( W' j# \( K3 ~. G+ ~
5、添加50 ng / mL的重组人IL-4和100 ng / mL的重组人GM-CSF
# ?8 ?$ z0 F  ?/ F' {6、两天后半量换液，同时添加IL-4和GM-CSF' n3 i$ T. T+ B& {
7、5天后添加TNF-α进行诱导50ng/ml，诱导1~2天
% P* @3 w8 b7 C1 V7 ?  C/ G+ t不知道这个方案会不会存在一些问题，因子的浓度合适吗？
: l. }! @* U: k1 l. E7 S; D诱导后的DC不增值，一般100ml外周血能诱导出DC细胞的量是多少？$ r6 d) G9 \9 Z/ P  T$ K4 w
流式检测CD80, CD86,CD83、CD11c、HLA-DR，做完表型分析，基本上就没有多少细胞了，或者根本就不够用来做表型分析.: A7 T; f2 Q1 E. e
请问下做DC-CIK细胞回输人体，要不要做流式分析？

flowguo

        以前养过，看步骤应该差不多，细胞因子浓度具体记不清了，不过很多文献上都有诱导方案，一般没有什么问题。我觉得单核诱导DC经常会混有很多淋巴细胞，贴壁后最好洗干净一点。
. c7 Y1 s5 j2 p! B# z9 j( q     以前都是200ml的血，诱导一个星期不出问题的话1X10^7没问题，纯度能有80-90%，多多少少还是会有淋巴细胞。不过时好时坏，有时候也很差，都不知道什么原因。
1 y) {1 l& `7 H; A# r( ?1 E3 b& S" b     表型鉴定我觉得你不一定每次都做吧，养多了有感觉的，树突的形态很典型，真要要求高的可以挑选着做，流式多标的话也要不了多少细胞。
: W! Q& F& S$ {! m; m/ O- V4 q. @% {- `      临床试验不是很了解，同问。

flowguo

        以前养过，看步骤应该差不多，细胞因子浓度具体记不清了，不过很多文献上都有诱导方案，一般没有什么问题。我觉得单核诱导DC经常会混有很多淋巴细胞，贴壁后最好洗干净一点。$ G' a) D; _: s" D1 M9 a! K  O
     以前都是200ml的血，诱导一个星期不出问题的话1X10^7没问题，纯度能有80-90%，多多少少还是会有淋巴细胞。不过时好时坏，有时候也很差，都不知道什么原因。
6 K' y$ k0 b+ J# D* O+ B  l' V     表型鉴定我觉得你不一定每次都做吧，养多了有感觉的，树突的形态很典型，真要要求高的可以挑选着做，流式多标的话也要不了多少细胞。5 P" T: X/ y/ c& q
      临床试验不是很了解，同问。

yubin083

想问下这样培养出来的细胞中有macrophage吗？如果有，大概有多少比例？

hwlightning

回复 yubin083 的帖子$ t2 H& @) v9 m8 `% B, a

! r) z/ e* Z( ]( X8 J( c. _" X我今天看细胞的时候发现有很多贴壁的细胞，但是贴壁的细胞也有很多树突状。

透明之蓝

3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时
+ }& [1 q7 p" ~& H 4、弃掉含非贴壁细胞的培养基
  N+ c3 J% A- e; Q1 k) i
7 X# B) J% U, g8 S* M& F- ?: O弃掉培养基要注意，格外小心，轻轻操作！！要不细胞会损失很多！！
0 ]  ]0 E/ j9 r! Y关于其它问题，同问！！

yubin083

回复 hwlightning 的帖子' O1 ^( y( C' n) A- R) k* Y
& V2 ^3 B" g( L/ ?
样子有树突，不一定是DC，有一部分可能是巨噬细胞，这种细胞有小突起，而且贴壁，比DC还牢靠

yubin083

关于血液中单核细胞的分化为Mφ和DC: x/ ?3 J+ q" [8 G. T6 q
这种关于这种DC（表面CD1+，CD11b+，CD14+/-）国际上是有争议的，至少已故ralph steinman教授就不认可

yubin083

诚然，从人体血液中培养获取获取DC亦然成为不少researcher的研究方法，我仅仅想了解依靠这种方法获得的DC的纯度到底有多少（排除淋巴细胞后），其表面CD表达的情况？

hwlightning

回复 yubin083 的帖子
2 C( k! e/ T6 c9 Q, `9 Z/ o" F! s
3 d% M, J6 |+ s- U+ A# ~5 B) r是不是成熟的DC细胞是悬浮的细胞，
! ]  }2 X3 U3 a我最近看我养的DC有很多悬浮的，和贴壁的，如果我半量换液的话会不会损失掉很多细胞？
( \% g7 o/ A2 k7 Q* s6 E4 Y0 ~