DC细胞的培养方案和流式检测？

hwlightning

1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。- s8 H' S8 _/ Z) l5 a0 @# v4 e
2、将外周血单个核细胞在铺在培养瓶中，用加入25 mL免疫细胞无血清培养基3 s) M$ l: X7 s- Z0 C- B" Y$ v
3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时1 {- |+ t% J1 c2 K- h
4、弃掉含非贴壁细胞的培养基
0 p- o0 S( _' f2 |+ E; E! w5、添加50 ng / mL的重组人IL-4和100 ng / mL的重组人GM-CSF
1 B- F2 ^) D' W6 q( K4 X( `0 x6、两天后半量换液，同时添加IL-4和GM-CSF0 i( {, h+ j9 C# e4 J
7、5天后添加TNF-α进行诱导50ng/ml，诱导1~2天, V, e4 B5 Y% K6 i% a2 a6 W& ?+ V
不知道这个方案会不会存在一些问题，因子的浓度合适吗？( E$ G( X$ b. n
诱导后的DC不增值，一般100ml外周血能诱导出DC细胞的量是多少？
' I* J* a$ ?+ w* P流式检测CD80, CD86,CD83、CD11c、HLA-DR，做完表型分析，基本上就没有多少细胞了，或者根本就不够用来做表型分析.
2 D3 O* E& X6 ?8 `2 }2 H* \请问下做DC-CIK细胞回输人体，要不要做流式分析？

flowguo

        以前养过，看步骤应该差不多，细胞因子浓度具体记不清了，不过很多文献上都有诱导方案，一般没有什么问题。我觉得单核诱导DC经常会混有很多淋巴细胞，贴壁后最好洗干净一点。
( b& _! P" u6 t6 _* a     以前都是200ml的血，诱导一个星期不出问题的话1X10^7没问题，纯度能有80-90%，多多少少还是会有淋巴细胞。不过时好时坏，有时候也很差，都不知道什么原因。
3 H2 L8 K, q* w9 P0 M; \+ i     表型鉴定我觉得你不一定每次都做吧，养多了有感觉的，树突的形态很典型，真要要求高的可以挑选着做，流式多标的话也要不了多少细胞。
# G) C$ M5 p* c8 T9 {! h; R0 y: l& z      临床试验不是很了解，同问。

flowguo

        以前养过，看步骤应该差不多，细胞因子浓度具体记不清了，不过很多文献上都有诱导方案，一般没有什么问题。我觉得单核诱导DC经常会混有很多淋巴细胞，贴壁后最好洗干净一点。
/ H! L5 N) N) C8 |     以前都是200ml的血，诱导一个星期不出问题的话1X10^7没问题，纯度能有80-90%，多多少少还是会有淋巴细胞。不过时好时坏，有时候也很差，都不知道什么原因。! z' Q& |$ W0 ^8 X& y- y6 P. Q0 a
     表型鉴定我觉得你不一定每次都做吧，养多了有感觉的，树突的形态很典型，真要要求高的可以挑选着做，流式多标的话也要不了多少细胞。; X) K. G9 H# }! `1 r
      临床试验不是很了解，同问。

yubin083

想问下这样培养出来的细胞中有macrophage吗？如果有，大概有多少比例？

hwlightning

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* l- U4 d( D7 Q  \/ `2 w
4 f$ ~$ A. I# S我今天看细胞的时候发现有很多贴壁的细胞，但是贴壁的细胞也有很多树突状。

透明之蓝

3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时5 M. M: M, {1 Q* a& m/ q# A
4、弃掉含非贴壁细胞的培养基- k2 z* ~/ Y% r5 T
' c! h4 [$ R! m, @% d) T
弃掉培养基要注意，格外小心，轻轻操作！！要不细胞会损失很多！！+ z4 w  B: g' N3 T
关于其它问题，同问！！

yubin083

回复 hwlightning 的帖子
. _9 E+ m/ Z& l. X2 f$ v( {. U. O2 `# ?
样子有树突，不一定是DC，有一部分可能是巨噬细胞，这种细胞有小突起，而且贴壁，比DC还牢靠

yubin083

关于血液中单核细胞的分化为Mφ和DC$ _4 M. H, k6 R0 r8 P- D
这种关于这种DC（表面CD1+，CD11b+，CD14+/-）国际上是有争议的，至少已故ralph steinman教授就不认可

yubin083

诚然，从人体血液中培养获取获取DC亦然成为不少researcher的研究方法，我仅仅想了解依靠这种方法获得的DC的纯度到底有多少（排除淋巴细胞后），其表面CD表达的情况？

hwlightning

回复 yubin083 的帖子  N( M5 X; i& R' @
, C1 w6 ^- T* `6 A: d- \; c2 |
是不是成熟的DC细胞是悬浮的细胞，
+ C2 ?2 Z9 F2 f6 z! M0 S我最近看我养的DC有很多悬浮的，和贴壁的，如果我半量换液的话会不会损失掉很多细胞？
, ?4 }. Z! c( ?% f