DC细胞的培养方案和流式检测？

hwlightning

1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。% _" e6 J5 ~) Z  E5 l! o1 N  w
2、将外周血单个核细胞在铺在培养瓶中，用加入25 mL免疫细胞无血清培养基  T: Q7 V% S6 _# V; W
3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时
. t' L! z: K+ g: G4、弃掉含非贴壁细胞的培养基
* x% g4 K0 w7 U3 c) M5、添加50 ng / mL的重组人IL-4和100 ng / mL的重组人GM-CSF
7 m" h+ f2 N/ K* r6、两天后半量换液，同时添加IL-4和GM-CSF
4 ]! }0 H% Q1 ]+ q* d' k2 O; k7、5天后添加TNF-α进行诱导50ng/ml，诱导1~2天! G5 w: W+ p8 ?& O( y
不知道这个方案会不会存在一些问题，因子的浓度合适吗？
6 |- G# X5 z' f& R' `, \6 G, z6 `诱导后的DC不增值，一般100ml外周血能诱导出DC细胞的量是多少？/ q9 J; z* w& R0 {9 f& s
流式检测CD80, CD86,CD83、CD11c、HLA-DR，做完表型分析，基本上就没有多少细胞了，或者根本就不够用来做表型分析.% i  R$ H5 E/ n$ Q# B+ r
请问下做DC-CIK细胞回输人体，要不要做流式分析？

flowguo

        以前养过，看步骤应该差不多，细胞因子浓度具体记不清了，不过很多文献上都有诱导方案，一般没有什么问题。我觉得单核诱导DC经常会混有很多淋巴细胞，贴壁后最好洗干净一点。# f8 J3 H4 o& H$ i# d+ b4 ?8 x9 C
     以前都是200ml的血，诱导一个星期不出问题的话1X10^7没问题，纯度能有80-90%，多多少少还是会有淋巴细胞。不过时好时坏，有时候也很差，都不知道什么原因。
! l9 x4 h' o+ O" I# @2 R3 P" D, o0 b     表型鉴定我觉得你不一定每次都做吧，养多了有感觉的，树突的形态很典型，真要要求高的可以挑选着做，流式多标的话也要不了多少细胞。
9 o4 o2 z+ R2 n+ i      临床试验不是很了解，同问。

flowguo

        以前养过，看步骤应该差不多，细胞因子浓度具体记不清了，不过很多文献上都有诱导方案，一般没有什么问题。我觉得单核诱导DC经常会混有很多淋巴细胞，贴壁后最好洗干净一点。" P7 f# t5 g, c5 S
     以前都是200ml的血，诱导一个星期不出问题的话1X10^7没问题，纯度能有80-90%，多多少少还是会有淋巴细胞。不过时好时坏，有时候也很差，都不知道什么原因。
9 i6 o1 |" F' v, l9 }2 S     表型鉴定我觉得你不一定每次都做吧，养多了有感觉的，树突的形态很典型，真要要求高的可以挑选着做，流式多标的话也要不了多少细胞。
7 E% k' B- p: D: p      临床试验不是很了解，同问。

yubin083

想问下这样培养出来的细胞中有macrophage吗？如果有，大概有多少比例？

hwlightning

回复 yubin083 的帖子4 z0 ?" U, A- V' j% g0 r1 |

3 G& U/ l8 x/ m2 |& l我今天看细胞的时候发现有很多贴壁的细胞，但是贴壁的细胞也有很多树突状。

透明之蓝

3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时
4 x$ F& E( o3 Q4 y3 h7 o& |. m3 ^ 4、弃掉含非贴壁细胞的培养基  F2 b; q1 \" ~* F, L# F
5 b" _/ r3 }4 a2 p( k8 v
弃掉培养基要注意，格外小心，轻轻操作！！要不细胞会损失很多！！/ E# `8 _- `4 N8 U6 Q
关于其它问题，同问！！

yubin083

回复 hwlightning 的帖子: N1 h1 ~4 x' i2 q- z
+ t" j0 B# ~. P6 k
样子有树突，不一定是DC，有一部分可能是巨噬细胞，这种细胞有小突起，而且贴壁，比DC还牢靠

yubin083

关于血液中单核细胞的分化为Mφ和DC& M0 m$ n) J- V
这种关于这种DC（表面CD1+，CD11b+，CD14+/-）国际上是有争议的，至少已故ralph steinman教授就不认可

yubin083

诚然，从人体血液中培养获取获取DC亦然成为不少researcher的研究方法，我仅仅想了解依靠这种方法获得的DC的纯度到底有多少（排除淋巴细胞后），其表面CD表达的情况？

hwlightning

回复 yubin083 的帖子  G2 f, }8 b+ w

8 R9 w) H7 a; _) `4 N5 t" _) _是不是成熟的DC细胞是悬浮的细胞，
1 z$ P. [4 O5 X, P+ U) G我最近看我养的DC有很多悬浮的，和贴壁的，如果我半量换液的话会不会损失掉很多细胞？
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