切质粒时的浓度

mhqh

我用限制性内切酶切质粒，1mL的反应体系（总体积1mL，含酶、buffer、质粒和水），我切200μg的质粒DNA，这浓度是高了还是低了还是刚好？% y- I4 ~) k$ r0 v3 Z" Y' l2 n

5 j# S* f. x* W& V: C另外，送的buffer好少好少啊，4,000 U 的酶（15 U/μl ），才送我500μL的buffer，那些buffer有叫10×H的，有叫10×M的，有叫10×K的，是不是可以稀释10倍用？是要刚刚好稀释10倍，还是要小于或等于10倍？

SSRSQ

你要用这么多的质粒干什么啊，一次切200微克。1000微升的体系切200微克浓度有点高，可以37度过夜。带的buffer很多的啊，10*就是10微升体系加一微升buffer，1ml反应体系才用100微升的buffer，通常buffer是用不完的。

86964109

回复 mhqh 的帖子; y, X1 c" ]5 F" ^5 |, x1 e' P4 @

( c* X; z% V* F6 I太夸张了吧 ，50μl体系一次切2μg足够了，2种酶各2.5μl，你用的是TAKARA的酶吧，10×H，10×M，10×K，是分别对应不同酶的需要的，分别对应不同盐浓度，一般什么颜色盖子的酶就用什么样色盖子的buffer，双酶切得看说明书或他们家产品目录上内切酶介绍选择共用buffer，打个比方如果你切50μl体系，那么除了质粒，酶 就加5μl 10*buffer，其余用水补

huangcong1988

你的体系是1ml？太吓人了，一般做酶切的话，体系是20μl吧？干嘛切这么多啊？我们20μl体系的话，浓度为1000ng每μl的质粒加1到2μl，然后酶加1μl（双酶切的话，一种酶加1μl），然后buffer加2μl，还有这个buffer要注意咯，buffer必须是两种酶活性最强时候用的buffer，其余的用水补足到20μl

zhangtcm

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  D7 p9 P  @  x$ M7 z4 s$ N& u5 N9 ?/ B
1mL的反应体系，太夸张了，改一下吧。

zhangtcm

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+ h: A9 o% m# _$ J) t; J( t  [
. v# w1 {# J+ {给你参考一下
' T2 d; O: K4 v/ E$ M
; l! w. j, U  {! |; Z$ mDNA分子的限制性内切酶消化
' ^) |8 C" B. f8 x  E0 s& S$ J" ?7 U# {
限制性内切酶可特异地结合于一段被称为限制酶识别序列的DNA序列位点上并在此切割双链DNA。绝大多数限制性内切酶识别长度为4、5或6个核苷酸且呈二重对称的特异序列，切割位点相对于二重对称轴的位置因酶而异。一些酶恰在对称轴处同时切割DNA双链而产生带平端的DNA片段，另一些酶则在对称轴两侧相对的位置上分别切断两条链，产生带有单链突出端（即粘端）的DNA片段。1个单位限制性内切酶是指在最适条件下，在50μl体积1小时内完全切开1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。不同的限制性内切酶生产厂家往往推荐使用截然不同的反应条件，甚至对同一种酶也如此。但是，几乎所有的生产厂家都对其生产的酶制剂优化过反应条件，因此购买的内切酶说明书上均有其识别序列和切割位点，同时提供有酶切缓冲液（buffer，10×、5×）和最适条件，使得酶切反应变得日益简单。1 ]$ p' y8 b0 u6 z& m; |+ z
一、限制性内切酶对DNA消化的一般方案+ y% Z5 j8 w4 W* w' ~9 [1 q# q; B, V
1.限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
! h" O6 ]% Q  ?( ?# ~2.20μl体积反应体系如下：
# z3 q' K0 ~' C, g% Q" PDNA 0.2-1 μg
1 G$ P3 G1 F# N' Y5 q% |10×酶切buffer 2.0 μl+ O" v: e1 V) D
限制性内切酶 1-2 u（单位）
0 G: x: R8 C) A7 C! Y3 y加ddH2O 至 20 μl
5 J' n9 h- ~/ s2 t' ], t$ t( u限制性内切酶最后加入，轻轻混匀，稍加离心，放置于最适温度水浴并按所需的时间温育，一般为37℃水浴消化1hr。
* V( W2 X; H% G- d* X  `3.用于回收酶切片段时，反应总体积可达50-200μl，各反应组分需相应增加。
5 @5 O& }8 @9 [. @5 I; x6 V4.多种酶消化时若缓冲液条件相同，可同时加入；否则，先做低温或低盐的酶消化，再做高温或高盐的酶消化。
3 }& m8 O- C1 k5.酶切结束时，加入0.5M EDTA（pH 8.0）使终浓度达10mM，以终止反应。或将反应管在65℃水浴放置10min以灭活限制性内切酶活性。( p. |2 l+ H. J
6.如消化反应体积过大，电泳时加样孔盛不下，可加以浓缩：终止反应后，加入0.6体积的5M乙酸铵（或1/10体积3M NaAc）和2倍体积无水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃离心12000g× 5min。倾去含大部分蛋白质的上清液。于室温晾干DNA沉淀后溶于适量TE中（pH 7.6）。7 [+ }3 i+ e. A) V2 c: j6 @
7.如要纯化消化后的DNA，可用等体积酚/氯仿（1∶1）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。6 l3 s! k+ T5 W: a
二、电泳检测8 q$ k( m& U$ h2 H" h7 g! b5 z- n
取质粒酶切产物适量，加适当loading buffer混匀上样，以未经酶切的质粒或/和酶切的空载体（如有）作对照，采用 1-5V/cm的电压，使DNA分子从负极向正极移动，至合适位置取出置紫外灯下检测，摄片。 2 [% p& A/ F8 R* \
三、注意事项
) q0 B( `2 `1 K, z- k# M1. 浓缩的限制性内切酶可在使用前以1×限制酶缓冲液稀释，切勿用水稀释以免酶变性。
, v3 I+ h3 H7 o# G7 Q2 I& b: I2 l  O2. 购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。
9 `8 a+ C8 C2 ^2 h5 w) q3.尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。
+ k) E" d& M7 a2 K/ L4.通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。
3 \0 A8 K5 V9 {1 L5.注意星号酶切活力。
5 A# ?9 x  f  K0 ~+ E8 a( m0 O

mhqh

楼上各位，我要大量DNA。那我这么说吧，把问题改成这样：
$ v2 l) Q2 _) a  X) t- r* H) Z6 y
% {' c; d" y& }& o我要一次性切200μgDNA，总体积是多少mL比较合适？
- F4 `; V) K' s4 P) ?
# s6 u3 O3 G  k  j7 |6 |) h+ k（切了之后，我用苯酚氯仿抽提，用异丙醇70%乙醇洗涤，去掉酶和buffer）

mhqh

; k; X, V" X; Y( Y; C
2 S- d+ j  ]" ^' d) N0 Y; K楼上各位，我要大量DNA。那我这么说吧，把问题改成这样：
0 y( f- G2 f( U+ G& |7 H* H. f: `! }
我要一次性切 0.5～2.5 mg（毫克）DNA，总体积是多少mL比较合适？/ I) \4 j) }9 P; V, _  v

! `" c) W4 E2 Z! k# [（切了之后，我用苯酚氯仿抽提，用异丙醇70%乙醇洗涤，去掉酶和buffer）

mhqh

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* G; g1 d) t# {- E) i3 Y! I, H4 U& K; T; V0 f# @# e9 X' z' \/ F
非常感谢你！ 但是我想要一次切200～2500μg（就是0.2～2.5mg）。所以问问切的浓度

mhqh

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/ U) [: T6 M# Z- j
5 }& @6 \: I0 d我要一次切0.5~2.5mg（毫克）