质粒酶切检测如何选择酶切位点？

kephort

现在在提取的有4种质粒，每种都挑了2-3个克隆，请问怎么进行酶切鉴定啊？3 @+ o9 H' ]( L  e, F* X4 Z! R
选择单酶切和双酶切要注意什么？如果做PCR检测，引物是选哪个区段呢？什么情形下要做测序？

军医

双酶切注意：1.两个酶的反应温度是否相同，不同的活就要分两次酶切# h! D) Y6 _$ g: x! |( N. ~! c
                     2.注意内切酶是否是对甲基化敏感，有的酶需要用GM110这样的菌株转化，得到的质粒才能被切开。
( `" f6 w) o4 s1 e                     3.两种酶是否有公用的buffer，无公用的buffer的话就要分两次切了。
" c6 R1 }' e& M. R& u8 q                     4.不要把目的片段切开，无论是双酶切还是单酶切都要选在质粒上有单个酶切位点的内切酶。0 b# [; H! @. @* \
                      5.单酶切和双酶切最好都做，保险。
& B' w* ~3 B9 m+ ~$ r3 Z- pPCR检测：    1.引物一般设计在插入片段两侧，如果是别人给的商业化质粒，最好在用测序引物测下多克隆位点，防止多克隆位点有突变。
, C- P. E4 \' N: w( J* b' W                     2.如果是插入片段的话，最好测序鉴定一下。PCR产物只看大小就能确定了。
- |; |( W3 }$ r$ f                     

mzaq2006

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3 e; Y4 y1 j0 }& I9 j: D- g: {9 F
那请问你知道miRNA的引物怎么设计的吗

86964109

! V9 P8 G4 b) U/ G! E7 `1 }' I. ^; x
" ^; L# V' A% l! a) h) M, Z& }回复 mzaq2006 的帖子
* \7 L% Q. e- L3 W9 l& u
, _3 W" r1 w! e2 Q: }有茎环法和加A法，一般用茎环法比较多可以参考以下文献 Real-Time PCR Quantification of Plant miRNAs Using Universal ProbeLibrary Technology.pdf (219.14 KB)

2013-1-14 08:08 上传

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goast8

一般情况下，怎么插入怎么酶切鉴定就可以了。
* g! F& f, o0 c如果是特殊方法插入，无法用插入的双酶切鉴定，可以用插入片段外部的酶进行酶切，这时可能需要你对载体及你的插入序列有完整的信息。
7 O' T6 ^+ Z. X9 W7 M1 U现在分子克隆的常用酶，基本双酶切组合都没问题。也可以考虑快切酶鉴定，10多分钟就可以。
# `7 F$ V0 }! O$ f4 q  upcr检测一般也用你之前克隆时设计的引物进行就可以了。一般情况下都是要测序确认的。

mzaq2006

回复 86964109 的帖子
/ u' R0 ]6 c" Z$ {: w
$ \7 x0 l$ M3 f4 |; Y) y0 m非常感谢您的回复。我自己也了解到，茎环法涉及3条引物，一条是RT引物，一条是正向引物，一条是反向引物，一般都用的是通用引物，我有个问题是，反向引物是否可以针对不同的miRNA而设计特异的引物呢？什么情况下需要这样做呢？就是说，你必须要设计特异的反向引物。希望能得到解答，谢谢。

86964109

回复 mzaq2006 的帖子! \# g3 \' Q" [: i/ G

) F/ F( `- y6 P/ _" m" G; y' W6 L应该一般是不用的，因为反向引物对应的是RT引物上通用的序列部分，退火条件如果和正向引物能匹配，基本上是不用换的，不过如果说和正向引物错配实在太多的话，可能需要考虑一下