分离PBMC时的疑问？

gengtongyu521

分离PBMC时，有时会多吸取一些下方的分离液，以免细胞的浪费，这样，再离心时会不会不容易使单个核细胞离心下来，而悬浮在液体中呢？

Jonathan

不会。因为洗的时候用的是PBS，两个应该是可以互溶的。。
5 L2 \6 W5 @2 c; V: m

HHvivian

如果有这种顾虑，PBS加多点。我也做过PBMC的分离，但未出现过单个核细胞离心不下来的情况。PBMC的分离还是比较容易的。

defu

操作基本过程如下：" u' L4 p7 n: h2 ?& [5 e

. O0 E& o6 V1 ^3 \& s1、抗凝血约8ml，2h内收集，混匀充分；6 F$ N! R4 O: C9 j0 i% Y" r; _

( w! Y1 d9 L( Z2、复温淋巴细胞分离液及1640；（室温自然复温2h或水浴锅中1-5min）
- `* V6 T) j' E  d+ O) a9 z# d+ k: x4 ]' e2 G0 M/ f* Q! ^
3、2支15ml离心管中各加入4ml淋巴细胞分离液，离心2min离下管壁上液体；8 U' g- S4 K, K% `2 N8 B; [' K$ ?

8 ?) C; L6 K; U  {- f4、将8ml血吸至50ml离心管中，加入约8ml1640，混匀；
. c" b8 ~% g8 L; {* l" m# n) y( x' Q( d
5、使用BD产3ml一次性无菌塑料吸管，将混匀后的血慢慢加到淋巴细胞分离液上；" j% [1 ]' }1 h" {" \
/ J: J8 p9 P+ U. Z$ M
6、1600rpm（440g/min），30min离心；
/ I+ ]7 ~: A; ?; Z" M! J
6 F# W. U2 V! |- r7、吸取上层血浆，用玻璃吸管吸取PBMC层至一新15ml离心管，加入1640至14ml，混匀；
- G6 h" j# D3 O& \6 G8 v. a2 Q
) l4 i. c2 x  U! x( _- L' q! ]; V8、1300rpm（290g/min），10min离心；
1 B) J7 H+ @  E9 N9 ~8 x; j  R7 f; C7 Z/ v
9、同样方法再次洗涤。
; v/ `, I$ }& A, s2 i& {0 M3 Z, W) e% p" ~2 g$ \" b& C/ j- b

pengxuleo

回复 gengtongyu521 的帖子
# T% x( q( G$ Y* H, c) g4 k, m9 c0 p& _
不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

回复 gengtongyu521 的帖子7 _& |. a% _- A, z
& O4 y5 @6 z& I: y
不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

回复 gengtongyu521 的帖子' R* [! y' v: r5 y
( e9 v& h# T. {# M8 c# d4 s( |: F  l
不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

easternliu

上面的人吹牛，我之前有遇到，细胞都跑到分离液当中了，所以吸了很多分离液，当时头脑发热没混匀，所以离心出现你说的现象，细胞没下来。所以吸了分离液一定要混匀，尽量不要吸太多分离液，如果没办法太多了，可以适当增加离心转速。关键是要混匀。。。

sunny.yc

回复 gengtongyu521 的帖子
% C. A1 z. {1 f9 q8 @& P; C- O- q4 k+ ~% [2 e
多吸一些没关系，只要别吸太多淋巴细胞分离液当中的”杂质“和下面的其他细胞就行了，然后用DPBS或1640混匀一下细胞，完全没有问题，我一直都是这么做的

pengxuleo

回复 easternliu 的帖子0 ]2 v! X5 [  N8 E0 v2 f
* a% O5 k0 {3 W! l" j, P) c
你说我吹牛也得好好看看内容啊，混不混匀是实验常识问题，没人会专门提出来