分离PBMC时的疑问？

gengtongyu521

分离PBMC时，有时会多吸取一些下方的分离液，以免细胞的浪费，这样，再离心时会不会不容易使单个核细胞离心下来，而悬浮在液体中呢？

Jonathan

不会。因为洗的时候用的是PBS，两个应该是可以互溶的。。
+ u5 X" B/ q# A; v# d

HHvivian

如果有这种顾虑，PBS加多点。我也做过PBMC的分离，但未出现过单个核细胞离心不下来的情况。PBMC的分离还是比较容易的。

defu

操作基本过程如下：* A# K& |& b$ C: w) ~$ A+ S. F: h% E

* e1 z# p# m4 z$ a7 C1、抗凝血约8ml，2h内收集，混匀充分；; H* x7 P9 q# f3 C. R
" A. H7 y, _# \4 F4 m
2、复温淋巴细胞分离液及1640；（室温自然复温2h或水浴锅中1-5min）
: [. Q4 E, v8 Z+ Q, ?7 W9 A
- [* D) D; ?: z, @6 n3 a& C6 e3、2支15ml离心管中各加入4ml淋巴细胞分离液，离心2min离下管壁上液体；
) X/ O. n9 G. d! P: b
: B" ?: k' [" N, T6 ~4、将8ml血吸至50ml离心管中，加入约8ml1640，混匀；% M! f+ }% \% K' Y+ I
1 {  N2 t( s7 t9 a
5、使用BD产3ml一次性无菌塑料吸管，将混匀后的血慢慢加到淋巴细胞分离液上；
' |9 A) x5 r$ H! A2 j0 Y( k) M7 u& t: i, E( o% h4 f
6、1600rpm（440g/min），30min离心；  B5 I7 w6 a5 L; q8 q
  l/ F5 c4 W: x! o" w  F8 q3 X2 ~
7、吸取上层血浆，用玻璃吸管吸取PBMC层至一新15ml离心管，加入1640至14ml，混匀；; L2 ^; p7 ^. C# c2 X! Z5 f; Y- y

/ \: p9 H- v( d8 @4 x% R8、1300rpm（290g/min），10min离心；& n' Z# Z1 O* b$ E
# M. Z- V6 h6 U. u2 Q, k" Y9 U
9、同样方法再次洗涤。  `! c/ N& b; }9 b

0 ^- u* d, e$ `% ]

pengxuleo

回复 gengtongyu521 的帖子' r. l9 N! |$ s  M9 c/ p

# p, M9 w3 ^$ \5 b( Y3 ]不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

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( a) d) x; `! V2 J. f9 G" [9 ?; n* o6 a4 }( B1 C
不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

pengxuleo

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+ N0 j# L2 T6 k. F. r! U/ ?不会的，能不能离心下来要看缓存也的密度啊，你多加PBS洗，这样就稀释了分离液的密度，细胞就可以离心下来了

easternliu

上面的人吹牛，我之前有遇到，细胞都跑到分离液当中了，所以吸了很多分离液，当时头脑发热没混匀，所以离心出现你说的现象，细胞没下来。所以吸了分离液一定要混匀，尽量不要吸太多分离液，如果没办法太多了，可以适当增加离心转速。关键是要混匀。。。

sunny.yc

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+ ^! S7 S1 Z! `% A5 @7 d4 P$ D0 n/ q2 Q; v% U$ m1 |# d
多吸一些没关系，只要别吸太多淋巴细胞分离液当中的”杂质“和下面的其他细胞就行了，然后用DPBS或1640混匀一下细胞，完全没有问题，我一直都是这么做的

pengxuleo

回复 easternliu 的帖子7 T* [) d/ ?% n% x
" ]3 \0 h. Q. `) x; Y( f
你说我吹牛也得好好看看内容啊，混不混匀是实验常识问题，没人会专门提出来