求助：shRNA的问题

liumenghan

刚开始做shRNA，已经设计出来几个序列。但是总怕这个shRNA 会对其他的基因造成一定的沉默作用，产生不可控的影响。
& N* e" F* F' @+ Z各位有没有什么好的排除方法？或者可以打消我这个疑虑？+ z3 E  c5 |6 X3 J" [
先谢过了

markllq

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shRNA完全没有offtarget是不可能的，最好的办法就是设计多对，我们一般至少要筛到三个有效的shRNA，必须至少敲到30%以下，得到的表型一致，基本可以认为没有问题。严格来讲，真要证明你的表型确实是因为target到你的目的基因引起而非off target引起，那你需要做rescue实验，就是构建你那个基因的克隆，而且将shRNA的靶序列进行同义突变，至少突变两个点，保证不会被shRNA降解，然后过表达看看是否能rescue，如果能，那就没有问题。

BNJN

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几个不同位置，并且blast之后没有与其他基因相重叠，就初步说明没有影响其他基因。如果敲掉后表型、其他基因表达变化情况相同，就可以说明变化是由目的基因的knock down引起的。如果一定要考究shRNA有没有干扰其他基因，很难，而且很有可能是KD后引起的变化。

老十

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" H3 ~+ W6 z- C: p; A- ^GFP和luciferase作为control就是认为带一段无意义的片段，然后转入细胞，表明我们这个Knockdown 是shRNA上的target片段起作用，而不是ShRNA 插入载体的作用，或是说不是单纯的转入shRNA载体的作用。也使得筛选过程中的control更严格。  _! a. [) O- ]$ s% s
没帮到你什么，自己多看paper吧。加油了，

liumenghan

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多做几个不同位置，只能保证一定会knock down。。好像也不能解决干扰其他基因的作用吧？1 |. i- H8 V$ W0 B; K7 M. t  k- p
另外GFP和luciferase是载体上的吧？这个做control有什么作用呢。。。
! z! c3 y( L& w6 m2 P2 l# N* {没想通啊，求解答。

liumenghan

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回复 老十 的帖子2 K4 n5 H& ^, \* }$ a
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没关系的，大家一起讨论进步。我也再边做边思考一下; Q! |2 Y5 w8 C, m2 d! h0 `6 m3 b
我最后还是挑了和别的基因重合率最低的几对shRNA。
0 v8 t2 M! b% q0 O我看了下书。现在感觉hit到其他的情况应该是不可避免的。只是knock down与他重合率60-70%的基因效率应该很低，低到可以忽略。毕竟沉默的RNA与其序列重合率是百分之百。
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BNJN

多做几个不同位置的shRNA就好了，如针对3‘、5’非编码区和CDS的；还要加control，如针对GFP、Luciferase的shRNA

老十

不好意思，我真的也没帮上你什么，我做shRNA 也很迷惑，即使我的目的基因下调了，会不会他同时脱靶hit到别的基因，后来只能自己通过其他方法验证了。看表型决定

老十

如果是sigma网站上的就要多试试了，自己筛选。别人文献里找到的序列也要自己验证。实在不行就要买公司的shRNA,当然也要验证。

liumenghan

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筛选和证明有效都要做的。1 R9 l3 A$ a4 `
可是我觉得公司的也不一定保险，我从sigma网站上看到了一些validate的shRNA 序列。放到NCBI上blast了一下。有mRNA跟设计的shRNA序列重复率，高的有达到 百分之百，而百分之七八十也很是常见。虽然跟目的mRNA 功能上有一定距离，总觉得不放心。, K" j) L* \/ q