求助：shRNA的问题

liumenghan

刚开始做shRNA，已经设计出来几个序列。但是总怕这个shRNA 会对其他的基因造成一定的沉默作用，产生不可控的影响。% p# B6 S. G) f
各位有没有什么好的排除方法？或者可以打消我这个疑虑？  X- X. D7 S5 N, |; g5 W- O: S: i. g
先谢过了

老十

这个，只有看人家用过的或是公司的才最保险，自己做那就要筛选，最后自己确定。

liumenghan

6 y; C* a. R0 v- G' @. B0 @' p
! y3 L2 K- _3 F回复 老十 的帖子
1 ?& P/ N# i8 k+ F/ g5 f# Q$ `, r6 y: T$ t1 H! E9 g
筛选和证明有效都要做的。
7 D( e/ ?$ K% G6 L* k! D" ^可是我觉得公司的也不一定保险，我从sigma网站上看到了一些validate的shRNA 序列。放到NCBI上blast了一下。有mRNA跟设计的shRNA序列重复率，高的有达到 百分之百，而百分之七八十也很是常见。虽然跟目的mRNA 功能上有一定距离，总觉得不放心。. y" {8 `% h0 @7 [+ I

老十

如果是sigma网站上的就要多试试了，自己筛选。别人文献里找到的序列也要自己验证。实在不行就要买公司的shRNA,当然也要验证。

老十

不好意思，我真的也没帮上你什么，我做shRNA 也很迷惑，即使我的目的基因下调了，会不会他同时脱靶hit到别的基因，后来只能自己通过其他方法验证了。看表型决定

BNJN

多做几个不同位置的shRNA就好了，如针对3‘、5’非编码区和CDS的；还要加control，如针对GFP、Luciferase的shRNA

liumenghan

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9 c. x) B. `# Q没关系的，大家一起讨论进步。我也再边做边思考一下) r5 J0 E, S& d5 k
我最后还是挑了和别的基因重合率最低的几对shRNA。* _, ]& v6 A0 e! D3 T+ r
我看了下书。现在感觉hit到其他的情况应该是不可避免的。只是knock down与他重合率60-70%的基因效率应该很低，低到可以忽略。毕竟沉默的RNA与其序列重合率是百分之百。
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liumenghan

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+ [& V9 u: D3 x4 ~
& }, W& ?5 D8 \/ |多做几个不同位置，只能保证一定会knock down。。好像也不能解决干扰其他基因的作用吧？9 L8 K" v$ H% |# p+ Y- s1 R
另外GFP和luciferase是载体上的吧？这个做control有什么作用呢。。。" l: f6 `+ n- e; Q3 _
没想通啊，求解答。

老十

) P" X2 K" e0 e$ W1 m% u3 ?# m5 m, L! b8 Q6 I
GFP和luciferase作为control就是认为带一段无意义的片段，然后转入细胞，表明我们这个Knockdown 是shRNA上的target片段起作用，而不是ShRNA 插入载体的作用，或是说不是单纯的转入shRNA载体的作用。也使得筛选过程中的control更严格。
% g  Q" g3 C3 \! c没帮到你什么，自己多看paper吧。加油了，

BNJN

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几个不同位置，并且blast之后没有与其他基因相重叠，就初步说明没有影响其他基因。如果敲掉后表型、其他基因表达变化情况相同，就可以说明变化是由目的基因的knock down引起的。如果一定要考究shRNA有没有干扰其他基因，很难，而且很有可能是KD后引起的变化。