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[请教] 求助:shRNA的问题 [复制链接]

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包包
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楼主
发表于 2013-3-12 18:33 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
刚开始做shRNA,已经设计出来几个序列。但是总怕这个shRNA 会对其他的基因造成一定的沉默作用,产生不可控的影响。8 z( p! x! ~2 `9 q0 r  _6 `
各位有没有什么好的排除方法?或者可以打消我这个疑虑?
$ u& ?$ k  A$ z) P4 a先谢过了
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沙发
发表于 2013-3-12 21:40 |只看该作者
这个,只有看人家用过的或是公司的才最保险,自己做那就要筛选,最后自己确定。
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藤椅
发表于 2013-3-13 12:40 |只看该作者
本帖最后由 liumenghan 于 2013-3-13 12:42 编辑 3 u6 \7 W& J& u
9 [; b. K, @! O
回复 老十 的帖子2 I0 K. T# B; H

2 O, ^; s8 Z3 D2 R筛选和证明有效都要做的。
! F. m( g' R5 n0 {可是我觉得公司的也不一定保险,我从sigma网站上看到了一些validate的shRNA 序列。放到NCBI上blast了一下。有mRNA跟设计的shRNA序列重复率,高的有达到 百分之百,而百分之七八十也很是常见。虽然跟目的mRNA 功能上有一定距离,总觉得不放心。, Q4 u$ Y2 c+ I: {+ L
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板凳
发表于 2013-3-13 16:15 |只看该作者
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如果是sigma网站上的就要多试试了,自己筛选。别人文献里找到的序列也要自己验证。实在不行就要买公司的shRNA,当然也要验证。
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报纸
发表于 2013-3-16 00:10 |只看该作者
不好意思,我真的也没帮上你什么,我做shRNA 也很迷惑,即使我的目的基因下调了,会不会他同时脱靶hit到别的基因,后来只能自己通过其他方法验证了。看表型决定
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地板
发表于 2013-3-18 10:25 |只看该作者
多做几个不同位置的shRNA就好了,如针对3‘、5’非编码区和CDS的;还要加control,如针对GFP、Luciferase的shRNA
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发表于 2013-3-18 14:52 |只看该作者
本帖最后由 liumenghan 于 2013-3-18 14:54 编辑 ; O9 i6 j$ q; k- M
% V0 r; q- b9 Q: P
回复 老十 的帖子( H  V5 C5 ^% {( T3 y) n
5 F# m; c' T: a+ E6 K0 O
没关系的,大家一起讨论进步。我也再边做边思考一下3 W3 i& l' |- ~* M7 J, R1 t
我最后还是挑了和别的基因重合率最低的几对shRNA。
+ T! A9 {1 I; r, h我看了下书。现在感觉hit到其他的情况应该是不可避免的。只是knock down与他重合率60-70%的基因效率应该很低,低到可以忽略。毕竟沉默的RNA与其序列重合率是百分之百。
7 I5 ~4 }3 q. E. W7 J* N; X
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发表于 2013-3-18 14:57 |只看该作者
回复 BNJN 的帖子
, Y- m6 P5 ?: x. z% {( U' `# `# F7 M, S# A
多做几个不同位置,只能保证一定会knock down。。好像也不能解决干扰其他基因的作用吧?
- U* J$ f* R0 p' L2 t$ }8 G3 m另外GFP和luciferase是载体上的吧?这个做control有什么作用呢。。。* Y, r7 H: t6 T' J
没想通啊,求解答。
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发表于 2013-3-18 15:52 |只看该作者
本帖最后由 老十 于 2013-3-18 15:52 编辑
8 b# A2 }. Q7 |* }; E
4 [3 q2 }- Q( e2 H- f5 jGFP和luciferase作为control就是认为带一段无意义的片段,然后转入细胞,表明我们这个Knockdown 是shRNA上的target片段起作用,而不是ShRNA 插入载体的作用,或是说不是单纯的转入shRNA载体的作用。也使得筛选过程中的control更严格。% k' \. u. c5 T5 E; J, j. v# o- }$ Y
没帮到你什么,自己多看paper吧。加油了,
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发表于 2013-3-20 12:33 |只看该作者
回复 liumenghan 的帖子; U( K" P0 h* r& c$ r) P& U4 D

, Z, _& Q9 u# I几个不同位置,并且blast之后没有与其他基因相重叠,就初步说明没有影响其他基因。如果敲掉后表型、其他基因表达变化情况相同,就可以说明变化是由目的基因的knock down引起的。如果一定要考究shRNA有没有干扰其他基因,很难,而且很有可能是KD后引起的变化。
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