求助：shRNA的问题

liumenghan

刚开始做shRNA，已经设计出来几个序列。但是总怕这个shRNA 会对其他的基因造成一定的沉默作用，产生不可控的影响。
( j, o& s6 A! M4 ?9 }/ D$ ]各位有没有什么好的排除方法？或者可以打消我这个疑虑？
! c2 v4 H/ J+ |) q# r9 }先谢过了

老十

这个，只有看人家用过的或是公司的才最保险，自己做那就要筛选，最后自己确定。

liumenghan

  S9 K" v% w! w6 r: N
6 e9 n. l/ Q% z2 t1 ]) [, h回复 老十 的帖子
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筛选和证明有效都要做的。: T3 u4 a/ u+ @+ K/ J. L/ A! J
可是我觉得公司的也不一定保险，我从sigma网站上看到了一些validate的shRNA 序列。放到NCBI上blast了一下。有mRNA跟设计的shRNA序列重复率，高的有达到 百分之百，而百分之七八十也很是常见。虽然跟目的mRNA 功能上有一定距离，总觉得不放心。
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老十

如果是sigma网站上的就要多试试了，自己筛选。别人文献里找到的序列也要自己验证。实在不行就要买公司的shRNA,当然也要验证。

老十

不好意思，我真的也没帮上你什么，我做shRNA 也很迷惑，即使我的目的基因下调了，会不会他同时脱靶hit到别的基因，后来只能自己通过其他方法验证了。看表型决定

BNJN

多做几个不同位置的shRNA就好了，如针对3‘、5’非编码区和CDS的；还要加control，如针对GFP、Luciferase的shRNA

liumenghan

: Y) c! K# k5 \% q$ V
  U0 M+ [: f3 n回复 老十 的帖子
! Y1 E: k% c5 z3 V0 l
1 O0 p5 a' X: f$ y, [4 q9 }没关系的，大家一起讨论进步。我也再边做边思考一下, \7 J' e+ `& E+ z
我最后还是挑了和别的基因重合率最低的几对shRNA。
7 r5 d, A" k4 l我看了下书。现在感觉hit到其他的情况应该是不可避免的。只是knock down与他重合率60-70%的基因效率应该很低，低到可以忽略。毕竟沉默的RNA与其序列重合率是百分之百。3 V# Z; H9 q+ g/ O5 q' x

liumenghan

回复 BNJN 的帖子
! z/ n. w7 ?5 e3 R" e# Z
9 m# W" F2 V$ E. \) K0 H多做几个不同位置，只能保证一定会knock down。。好像也不能解决干扰其他基因的作用吧？
; i# v4 I7 p8 o+ B0 }9 J另外GFP和luciferase是载体上的吧？这个做control有什么作用呢。。。9 [+ g% M8 b! [+ A
没想通啊，求解答。

老十

0 h/ X' R+ l/ z: E% k0 V$ O# M2 s3 y, N6 _  L1 l2 W* A; M7 M
GFP和luciferase作为control就是认为带一段无意义的片段，然后转入细胞，表明我们这个Knockdown 是shRNA上的target片段起作用，而不是ShRNA 插入载体的作用，或是说不是单纯的转入shRNA载体的作用。也使得筛选过程中的control更严格。
; _8 G3 i% p- x" H  e9 S- S没帮到你什么，自己多看paper吧。加油了，

BNJN

回复 liumenghan 的帖子* p8 W5 ]3 I" W+ A5 M

0 W: y0 r- @4 a8 `/ Q/ m8 D几个不同位置，并且blast之后没有与其他基因相重叠，就初步说明没有影响其他基因。如果敲掉后表型、其他基因表达变化情况相同，就可以说明变化是由目的基因的knock down引起的。如果一定要考究shRNA有没有干扰其他基因，很难，而且很有可能是KD后引起的变化。