电转试剂盒LONZA以及电转细胞与质粒比

hjd8886

求问LONZA电转试剂盒全名，用于电转角质细胞的用哪一个？电转仪参数？  b0 L& N7 t: s# U2 G
另外电转的时候细胞和质粒的比例大概多少合适？看之前论坛里发的“细胞和质粒的比例我用过30ug-80ug：106-107”这个是100万的细胞用30ug的质粒吗？

oooet

回复 云下的风筝 的帖子, Q$ F2 m6 c( Q+ H" x. e) y
. O3 t4 C3 N: G7 ~; o
加我qq吧  1270050018，不知道我的电转程序是不是能用于你的实验

云下的风筝

回复 genedu 的帖子% F. s  ^2 D  ~0 d' `3 h

5 D* t; n* u8 t您好，genedu，请问您是否有用过Lonza的试剂盒电转过T细胞，这块经验空白，买了个试剂盒，电转了好几次，活细胞就10%:L

wzm123hzy

前辈您好，我最近想用Lonzad 4D X-unit 电转仪转染脂肪干细胞。之前没有用过电转仪，想向您我请教一下：您们用的电转缓冲液是专门从Lonza 官网上购买的吗？还是直接用opti-MEM呢？打扰您了，谢谢。

genedu

回复 royltc 的帖子" b+ i3 }6 K/ i

- x6 X6 M. \* M' q$ S/ B+ g是一些细胞碎片之类的东西，有可能你还得多摸索几个转染程序

royltc

回复 genedu 的帖子
: N0 `+ C/ z$ i3 `  ~# x$ T5 {7 t$ H! f
你好，我用solution T转染的cho-k1 ，转染之后培养基中就有黑黑的点状或者片状的东西，细胞死亡也差不多一半的样子，请问那些黑黑的东西是什么啊？

缥飘实验员

回复 genedu 的帖子, E" N9 q4 s5 i- Q" a% G

/ I* j% @- N' s6 P. B1 W前辈好，请问有没有做过 H1和 H9 的电转，现在使用 lonza NucleofectorTM 2b device 仪器，0.22的杯子，细胞100万个，100ul体系。使用 A-023程序， 现在做了GFP  2ug、7ug 的电转实验，连 GFP 都没有转进去，零星的看见几个细胞。
) W1 l! {" r" L! C  f# J7 D1、转后接种到一孔六孔板上，细胞贴壁率很低不足20%，或者更严格的说只有10%，这个主要原因是细胞状态吗，还是操作有问题？对于这样需要融合度为多少合适，60%？80%，大概需要生长几天？还是电转前一天高密度接种第二天消化电转。消化我发现使用 TrypLE酶不容易吹打为单细胞，是不是 accutase 更好些？! x) L' \/ ~$ I3 C4 |; Q
2、电转液为一般的盐溶液，是这边的实验室的 protocol，具体配置不知道，转别的细胞是没有问题的。使用 bio-rad 的仪器用 PBS 作为电转液，效率也挺好的。这个是不是需要自己摸索，有钱直接买kit 是不是更好？
! A8 w- e4 E# z9 X- h- [3、现在处于预实验，摸索条件做细胞梯度好还是质粒梯度更好？
3 L# C. _( R0 n3 s% b3 z* Q4、电转实验细节上有没有特别好的建议希望分享一下，
# H. ]' |! g  C& O9 s* C' @- Q5 \- H% d9 i
说的有点乱，还请不介意，期待您的回复

canyon

Jonathan 发表于 2014-3-13 14:27 4 B1 I/ @: r) o# i% o/ o4 q, L
回复 sirius_zou 的帖子( ~8 p$ S, O( R( e- n/ J

* V: F3 t4 R! ?0 b0 X7 F. ?7 I我用了6ug。1m的CD34+cell。完全没问题。细胞会死一些。ips出的杠杠的

$ N  F& r2 v- J
Jonathan, 你的CD34+细胞的分离一般需要多少ml血液？

genedu

回复 刘金莹 的帖子
. M# p, I7 C5 S% O" r
3 m; x( W+ l- B0 ?9 P! g9 w真是对不起，真没电转过神经干，不过电转程序可以参考lonza网站

刘金莹

回复 genedu 的帖子
" `' w( w2 }/ X' d' d% D5 w+ C% e
请问  您做过神经干细胞的电转吗？ lipo2000的效率在1%左右