求助：小白求教IPS的各种鉴定方法

whether

烦请各位大虾详细说明

frankieisme

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) D! V2 o6 @' Z* V* {* B, p# h" F" N6 T; V# V! t* J2 Y
iPSC的鉴定：核型、基因表达、体外分化能力、体内多能性检测等多方面.

supercell

这是最早最经典的nature protocol，供参考。

whether

我自己总结了一下 大家看有什么问题& U* C  e- o% t: C: N$ X. o
; S! w% \, Z, F9 q/ f7 ~$ t: m4 e8 W7 H
yamanaka 筛选因子时使用的方法：在Fbx15敲除鼠的基因组内，Fbx15基因被neo基因取代。在成鼠角形的成纤维细胞中，内源的Fbx15 启动子关闭，neo不能表达，细胞在G418药物处理下会死亡；在圆形的多能干细胞中，Fbx15 启动子会启动neo，细胞能在G418中生长。成纤维细胞在体外培养后感染携带干细胞维持因子的逆转录病毒，如果能够被重编程成多能干细胞（iPS），就能逃过G418的选择压力，增殖形成细胞克隆
9 Z; l+ }# r2 z 1 E7 E$ w. W4 t
其他鉴定方法
0 p! k- B  {& w7 k& j1.Bisulfite Genomic Sequencing
/ [- V; A0 e3 t& ~亚硫酸氢钠基因组测序，分析iPS细胞中的去甲基化，保持甲基化状态: G1 u0 i7 f5 c/ r! i
! X+ n+ K, ]8 O6 k
2.Determination of Karyotypes and SSLP by PCR & J9 G3 O- l" h1 x
分析染色体组型与简单序列长度多态性（被称为第二代DNA）- [5 X) h5 L2 t  }4 C
" {- ~9 s6 r4 b; h% @5 L% H" |1 O
3.Western Blot Analyses % Z$ Z9 I  h  _! g( |) Y
通过Western Blot检测干性基因蛋白的表达
- a* O4 _- F0 B- C1 |" T
% U0 K1 L4 f* Q" l& K1 R% g9 B4.RT-PCR for Marker Genes $ g* }8 I2 E. S- g" F; v) |9 I
检测干性基因表达! ^. Q  j1 j) o, U( u

* ]% y& N1 a. \4 N+ L5.DNA Microarray   p4 A+ Q( l$ `' W! q
基因芯片。。。
+ X9 C8 [4 |: y' X, I0 { 4 }5 o1 t9 ]/ Q" x& Q  r9 J) p
6.In Vitro Differentiation of iPS Cells 0 U# v% j) \# ?+ T: K% j( a
体外分化。。。ips-mef4-7细胞皮下注射进裸鼠后，肿瘤分化出多种组织$ C  B* l  l! Y5 o" a! k! Q

chunlanchen

GIBH干细胞实验室所用的方法是：; n# @! ?: _0 z/ l: H: S# L$ a
1、插入鉴定：观察iPS是否插入了四因子
9 q% x  Z% h0 Z6 A5 C. _2、核型鉴定8 t4 v3 s7 j1 E3 Y& T3 C
3、Realtime PCR 检测iPS外源基因沉默及多能性基因的表达水平
; v2 v1 K! l7 {4、免疫荧光鉴定胚胎干细胞标志物在蛋白水平的表达
) s! B5 v: l: X1 ?5、双硫测序方法鉴定多能性基因启动子甲基化水平
' b0 r5 i, \  c# p9 q, s  u6、皮下注射畸胎瘤2 I% y: ^& E% K" V& n6 g4 F4 D4 K
7、嵌合体注射鉴定分化潜能