求助：小白求教IPS的各种鉴定方法

whether

烦请各位大虾详细说明

frankieisme

回复 whether 的帖子
, I1 h' |% z1 C' r) n1 [8 W# k- \4 A' l2 x
iPSC的鉴定：核型、基因表达、体外分化能力、体内多能性检测等多方面.

supercell

这是最早最经典的nature protocol，供参考。

whether

我自己总结了一下 大家看有什么问题1 o( M' ?# I  }" u4 }" g0 ^
$ g& i' ?: b) U% K
yamanaka 筛选因子时使用的方法：在Fbx15敲除鼠的基因组内，Fbx15基因被neo基因取代。在成鼠角形的成纤维细胞中，内源的Fbx15 启动子关闭，neo不能表达，细胞在G418药物处理下会死亡；在圆形的多能干细胞中，Fbx15 启动子会启动neo，细胞能在G418中生长。成纤维细胞在体外培养后感染携带干细胞维持因子的逆转录病毒，如果能够被重编程成多能干细胞（iPS），就能逃过G418的选择压力，增殖形成细胞克隆
) y2 W& j& }3 @: M2 I; m& D & d$ {, t" p+ d6 \# B, b, [+ Y. z0 j
其他鉴定方法. ~) G8 w/ Z" ?  j, i" U4 R
1.Bisulfite Genomic Sequencing + S$ ?( q2 Z5 S
亚硫酸氢钠基因组测序，分析iPS细胞中的去甲基化，保持甲基化状态
( o- o, Z, I! p  n) X8 i7 v6 y* b
1 {& ?$ Q: ^0 p4 e4 x2.Determination of Karyotypes and SSLP by PCR 2 S/ @  ?6 F+ e" c% F
分析染色体组型与简单序列长度多态性（被称为第二代DNA）
: B8 e- j8 S" H* W2 b1 U3 x
5 D) g) B' b4 ?8 A+ v$ q/ N3.Western Blot Analyses ( d7 A$ s; }- O2 j- o7 \/ E$ k
通过Western Blot检测干性基因蛋白的表达
7 |, c: t; l6 C $ N0 y, t$ s! @8 t. j
4.RT-PCR for Marker Genes ! t6 P2 V/ R) h( r( @( @& G7 |
检测干性基因表达
* ?3 F8 b  G, n1 i& z3 j 7 R8 q7 A! k9 `4 x
5.DNA Microarray
$ \) {9 C! m9 v- z3 h基因芯片。。。
0 u5 V: P! R; E: V! F 8 t" A: h4 k& d/ f4 v3 }+ q8 x- F8 B
6.In Vitro Differentiation of iPS Cells # h2 g3 b8 f0 U5 T5 h* D$ |% E
体外分化。。。ips-mef4-7细胞皮下注射进裸鼠后，肿瘤分化出多种组织8 h5 y8 ?9 Z) C3 `

chunlanchen

GIBH干细胞实验室所用的方法是：
  {0 W/ G) b8 c) q5 ~1、插入鉴定：观察iPS是否插入了四因子
& J/ ~" ?' c" U0 I4 ]9 _8 J2、核型鉴定% k8 M+ ?8 d2 p+ A
3、Realtime PCR 检测iPS外源基因沉默及多能性基因的表达水平& G; z; w1 V9 J. H. q: ?
4、免疫荧光鉴定胚胎干细胞标志物在蛋白水平的表达1 M3 d  d% P" S; l
5、双硫测序方法鉴定多能性基因启动子甲基化水平
% u  [! F7 U; h( q9 t: D6、皮下注射畸胎瘤
5 r+ U" O, A" H0 Z, \- w; J7、嵌合体注射鉴定分化潜能