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本人最近的试验遇到一些问题，望各位战友能多提宝贵意见。7 d9 l2 _7 K( ~' C% b$ g( _. t- q8 }5 C
. x- Z7 O e" P6 e: f; O自己想获得几种目的蛋白（四因子OSKM蛋白），做一些蛋白的功能试验。正在用pET-28a表达系统（一种常见的成熟的原核表达系统）表达目的蛋白（OSKM），前期已成功获得了pET28a+目的蛋白基因 的质粒，转化到BL21感受态中，经IPTG诱导表达后，想验证诱导表达是否成功了，遂做了一个Western Blot。由于第一次做WB,走了不少弯路。结果和过程如下：2 t$ V1 C7 M4 p: u# {; ^: z1 @
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1.蛋白的提取：第一次发现提取的菌体过多，裂解液加的不是很多，可能存在裂解不充分的可能。第二次减少了菌液的用量，加了足够的裂解液，进行了充分的裂解。
% R" p+ ~3 [8 Z; i! f" }# [5 m$ d 备注：裂解液是碧云天的，主要是用来裂解细 胞的，后期考虑用超声波裂解的方法。裂解液中加入了PMSF. z# e3 `! S$ [# i* e" ?; r9 V/ Z
疑问：裂解后的菌液，经离心取上清，发现上清很清亮。裂解的整个过程中也没有发现粘稠状的液体，这正常嘛，不是说可能有DNA嘛？？？
6 b; F, |$ y- s1 q2.蛋白的变性：加入蛋白上样缓冲液，并在沸水浴中加入5分钟。4 v/ h8 k! Q# `/ w, T' M- b: N3 ]
疑问：我看有些地方是加热10分钟，想问下这个可影响后面的结果？？？
: q) M$ a9 C& T) Q, G" O3.SDS-PAGE：首先对上述样品跑了一个SDS-PAGE,进行考马斯亮蓝染色。染色的结果发现有很多的条带，在蛋白预染Marker附近，也发现了与目的基因蛋白差不多的条带（只能说 差不多，真正的大小有一些偏差） 由于没有纯化，所以条带比较多。
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' \: M& T$ a2 g V( ^" N- H5 f: R于是对蛋白样品做了后续的WB，发现没有目的条带。于是在师兄的建议下，首先用内参跑western blot，又出了新的问题。内参用的是Tublin2 X; Z+ M1 ^% Q& U) c
1. 蛋白的提取:首先获取iPS细胞,用上述方法进行裂解 变性。2 ~% m* X# T- ~4 |" r
2.SDS-PAGE电泳：条件浓缩胶 80v 分离胶 120v 恒压，由于考虑到考马斯亮蓝的不可逆性，就想后期做立春红染色，来检测转膜效率。
( `3 c% u3 ~) I, T; z/ t# a3.转膜条件：恒流：120mA（有点不记得了，回去查下，应该差不多） 能 确保在4度下进行 转膜1.5h-2h。结果：发现蛋白预览Marker转到PVDF膜上了，并且很漂亮（亮度 和 各个带之间的距离 及 形状）$ X: Z+ a" w8 G4 L
4.丽春红染色：用丽春红 染色 发现 无条带，fuck！咨询了一些人，也不知道具体原因，建议往后做
7 H. j2 b% q' ~; F" \ r% |5.将丽春红洗干净后，封闭 4度过夜
- }" _" P- H3 `) c6.一抗孵育 二抗孵育 暗示中ECL发光试剂显色，发现无结果，··· ··· 失败！- {, P" \1 |) `8 l6 P+ v
7同时自己也验证了下二抗和发光底物：将发光试剂A和B，各1ml等体积混合，在暗室中加入1ui的二抗，发现有明显的荧光，证明二抗和发光试剂应该都没有问题
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实验结果：目的蛋白就不说了，内参的western 也没做出来，都做了一个月了！唉，效率有点低
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不知道在哪出问题了，有点长，有点乱！感谢那些仔细看完帖子的，更感谢那些给出意见的
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发表于 2013-5-23 23:03
发表于 2013-5-24 10:30
