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本人最近的试验遇到一些问题，望各位战友能多提宝贵意见。; J% l/ Y9 Z: |! v
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自己想获得几种目的蛋白（四因子OSKM蛋白），做一些蛋白的功能试验。正在用pET-28a表达系统（一种常见的成熟的原核表达系统）表达目的蛋白（OSKM），前期已成功获得了pET28a+目的蛋白基因 的质粒，转化到BL21感受态中，经IPTG诱导表达后，想验证诱导表达是否成功了，遂做了一个Western Blot。由于第一次做WB,走了不少弯路。结果和过程如下：8 z. I( {7 X/ s3 q
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1.蛋白的提取：第一次发现提取的菌体过多，裂解液加的不是很多，可能存在裂解不充分的可能。第二次减少了菌液的用量，加了足够的裂解液，进行了充分的裂解。. C2 A: |4 j( A" j& N! d) A% j
备注：裂解液是碧云天的，主要是用来裂解细 胞的，后期考虑用超声波裂解的方法。裂解液中加入了PMSF$ H: \) ~9 ~* N9 s6 \: \
疑问：裂解后的菌液，经离心取上清，发现上清很清亮。裂解的整个过程中也没有发现粘稠状的液体，这正常嘛，不是说可能有DNA嘛？？？
4 v( l! Z. N, `. H& u0 @) J$ A2.蛋白的变性：加入蛋白上样缓冲液，并在沸水浴中加入5分钟。* |1 J! p! L/ W" W# {6 O8 z# c
疑问：我看有些地方是加热10分钟，想问下这个可影响后面的结果？？？
5 R0 s2 `3 j4 t7 H5 A3.SDS-PAGE：首先对上述样品跑了一个SDS-PAGE,进行考马斯亮蓝染色。染色的结果发现有很多的条带，在蛋白预染Marker附近，也发现了与目的基因蛋白差不多的条带（只能说 差不多，真正的大小有一些偏差） 由于没有纯化，所以条带比较多。0 z. C0 s, r! `0 ^. H' j
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于是对蛋白样品做了后续的WB，发现没有目的条带。于是在师兄的建议下，首先用内参跑western blot，又出了新的问题。内参用的是Tublin- Q- d- b) v- A6 j( K
1. 蛋白的提取:首先获取iPS细胞,用上述方法进行裂解 变性。2 U0 p. ~6 C% _8 T' j* A
2.SDS-PAGE电泳：条件浓缩胶 80v 分离胶 120v 恒压，由于考虑到考马斯亮蓝的不可逆性，就想后期做立春红染色，来检测转膜效率。
0 {$ u) t s0 J8 r; Q3.转膜条件：恒流：120mA（有点不记得了，回去查下，应该差不多） 能 确保在4度下进行 转膜1.5h-2h。结果：发现蛋白预览Marker转到PVDF膜上了，并且很漂亮（亮度 和 各个带之间的距离 及 形状）" M5 `8 l9 k. {/ O* A4 `6 ?5 e9 f
4.丽春红染色：用丽春红 染色 发现 无条带，fuck！咨询了一些人，也不知道具体原因，建议往后做
6 A B/ W P* d% s' D/ N5.将丽春红洗干净后，封闭 4度过夜
& ?+ ?. p7 h; e8 t6.一抗孵育 二抗孵育 暗示中ECL发光试剂显色，发现无结果，··· ··· 失败！
5 f& m% i; ^2 P# P% R7同时自己也验证了下二抗和发光底物：将发光试剂A和B，各1ml等体积混合，在暗室中加入1ui的二抗，发现有明显的荧光，证明二抗和发光试剂应该都没有问题; T% I' B% o0 K: m' U5 g% A
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实验结果：目的蛋白就不说了，内参的western 也没做出来，都做了一个月了！唉，效率有点低
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% `& |) s: Q, E" `5 _5 F2 H不知道在哪出问题了，有点长，有点乱！感谢那些仔细看完帖子的，更感谢那些给出意见的
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发表于 2013-5-23 23:03
发表于 2013-5-24 10:30
