表达载体构建-请教-大家都进来给点建议啊

Andyhigh

最近构建了一表达载体，载体图谱如图（pET28a）8 F, L1 d( W  D2 A2 u

* _1 ]) C, R6 P1 W& x自己在Hind III  和 Xho I  加入了  目的基因CDS区(去除密码子)+九聚精氨酸（9R，一种穿膜肽）    转化进BL21（DE3） 用IPTG 诱导表达
; R/ U9 [# x. o试验目的： 生产出带穿膜肽 和 标签的 目的蛋白，标签的目的是方便纯化
# W3 R, w- |- t2 x, R, u+ {/ [) S6 u. z/ }+ n/ T, r
0 @7 Z  \( \3 C. U& M
  N$ g6 e# h8 I. J3 U3 h
问题：
4 Z- g4 c9 ^$ l/ Y, z0 W) C  M9 c1. 在不加IPTG的情况下，T7启动子表达，但由于后面的乳糖操纵子不表达，所以该载体不表达，是不是可以这样解释IPTG的诱导原理？ 想确定下7 [+ q, B# q6 T; I* l! B; a' `
2. 自己构建的载体：   在蛋白的N端：含有两个标签（His 和 T7，我看T7 有起始密码子ATG，而His 没有，这是个偶然现象嘛？），并且我插入的基因后面还有一个His标签，我想问一下我表达后获得的融合蛋白，是不是含有三个标签（两个His  和 一个T7）???   
) f' h1 ]5 Q" x" T+ f! Y5 p3.  原核表达载体翻译需要SD序列，也即载体上的rbs，我想问下 翻译什么时候开始；是在rbs后的第一个起始密码子（ATG）那嘛，如果是我的载体是否构建错了？？？  还是在我的目的基因的起始密码子那里？？？ * y( ]& ~' R$ Y, D# F# g
4. 并且自己目的基因后去除了密码子，我想问下我的表达载体上什么时候终止翻译 ？ 如果是到终止子结束转录（翻译也同时结束），那后面有很长一段是自己不想要的基因序列 （如 后一个His 标签到T7终止子，大概100bp左右）,感觉会影响到自己蛋白质的性质。
) {5 w" @& C( A" G$ ?0 ^3 e, U/ J2 J7 p6 U9 Y" i7 o8 W5 w7 Q
自己是新手，望各位高手解答，谢谢了！！！

Andyhigh

图谱

2013-9-2 09:57 上传

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Andyhigh

真心想知道自己构建的载体是否存在问题，纠结当中！！！

neuralstem

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5 Z0 o0 p( ^% K) a! Q: e; [/ f- h7 F' b& ^0 k+ ^5 y; h
看不清你的图。 简单回答一下你的问题吧2 ]+ m( T4 `% P
1. 不明白你为什么纠结这个
& G' T9 y/ q: A  u8 E2. 如果HIS和T7在N端，那么从ATG开始表达。如果HIS在T7的前边，那HIS就不表达（因为没有ATG）。 C端的那个HIS是在STOP CODON的前边还是后边？如果前边就表达，后边就不表达。
1 m2 |1 _0 S7 q3. 原核的没做过不清楚
/ K  l) d% K$ d. \5 r9 N( ^4. 你应该在你需要的蛋白+TAG之后加上一到两个STOP CODON， 比较保险。 否则C端不知道会出来什么怪东西/ o2 r0 B) M) ~) T+ J9 |, A

! F: f) _, o* F3 h0 A+ z

86964109

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/ d8 i6 `0 R3 q1 C: i9 e1 Y
& ~# V6 a, e2 g" ?. Q, F! x6 M“去除密码子”？你是想说去除了终止子吗，
1 R- g6 }& w/ T, O  `3 v$ g% R2 U: {* C
转录是从第一个ATG开始的，Hind III  前的NdeI和NheI都有ATG，因此如果按照你的插入位置，转录是从前面开始的，所以你要注意数清自己的ATG位置，能够通读，不要移码。
# P6 U( n0 n. o0 r3 m$ W
: ^! S, d# J; f% l如果不想要目的序列后面的多余蛋白，那就自己加上终止子呗