|
 
- 积分
- 344
- 威望
- 344
- 包包
- 1165
|
给你个流程吧：
. Z( X. o# i' G R d# c" h+ w4 e, g1. 猪场采集的睾丸样品置于含3倍双抗pbs的离心管中（离心管与冰袋一起放置于盒子中），带回实验室，置于4度冰箱。
" i$ n) y5 n2 |( g1 z2. 需要灭菌的东西：手术器械（5把小剪刀、2把大镊子、8把小镊子、2把手术刀柄、100目和200目的滤网各一个）、纱布、PBS、超纯水、离心管（1.5、15、50ml）、血清瓶、枪头、蓝盖瓶、小烧杯、玻璃皿、毛巾。
" N& S& @' u2 L, E% W4 G9 {; W3. 提前配制DMEM、双抗、PBS、胶原酶（2mg/ml）、胰酶（7mg/ml）。
9 q' o8 J7 @. N% g, d" ~5 `' N4. 取出采集的新鲜睾丸样品，在含3倍双抗PBS的50ml离心管中洗3次，转移到含75%酒精的50ml离心管中浸泡并不时摇晃5min，然后转移到含3倍双抗PBS的小烧杯中清洗后再转移至含PBS的另一小烧杯，如此再 重复1次（总共过3个小烧杯）。! S: f n. U/ G7 V2 j) k
5. 将睾丸样品从最后一个小烧杯中转移至玻璃皿中，剪去外侧的浆膜，注意不要将白膜剪破。
4 M K' S9 y1 I$ J5 L3 e, v2 A! V0 {6. 将睾丸样品在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗3次（依次过3个玻璃皿）后转移到一个新皿中，加入少量PBS，用镊子夹起手术刀片装在刀柄上并在酒精灯上灭菌，用PBS降温后剥离组织。4 u# ]% F" S- X
7. 剥离后的组织在含3倍双抗PBS的玻璃皿中漂洗1次，转移至一个新皿，用剪刀剪取组织，不要剪到白色的结缔组织。用镊子将小块转移至含有胶原酶的50ml离心管中，封口胶封好，震荡数次后放入37度水浴锅消化。! j* [9 k" M' ? U5 F( h' P
8. 胶原酶消化，根据消化情况可先将已消化出的小管分出，剩余组织块继续消化。0 u! Z7 \% l/ i5 K+ i. v
9. PBS洗4次除去血细胞，第3次洗时加入Dnase。
1 Y$ J, L2 r( w& @) `! O10. 胰酶消化并加入Dnase，严格控制消化时间，保证活率。
3 a- e/ r3 b; K( p. p11. 血清终止消化，细胞悬液依次过100目和200目滤网。6 }: n# t" Y/ r( h8 D
12. 离心，DMEM重悬，根据细胞数目接种至大皿，进行差异贴壁。
& R( S: i2 X2 k13. 差异贴壁（15min-20min-25min-30min-35min-40min），接种的细胞数量和活力不同贴壁时间可有差异，若细胞贴壁情况不佳可延长贴壁时间，贴壁性原细胞过多可适度吹打。- F3 x$ W$ Z0 k, W- j$ f8 J- G
14. 收集差异贴壁后的悬液，离心，PBS洗3次减少细菌数量，接种至含5%血清、2~3倍双抗的培养基中过夜。) a4 N+ L- K1 E, F4 s
15. 第二天收集吹打和稀释10倍胰酶消化后的悬液，可得到高纯度的性原细胞，若支持细胞数量偏少，可在分出性原细胞后，用胰酶原液消化出少量贴壁的支持细胞。若仍可观察到细菌，再用PBS洗3次。( s% T$ P7 r/ S4 a
|
-
总评分: 威望 + 20
包包 + 40
查看全部评分
|
发表于 2013-10-11 10:24
。不仅形态上很难鉴定（就算筛选完之后），貌似都很难遇到典型的串珠样克隆；另外比较麻烦的是，总是支原体污染，比较恶心。