有关精原干细胞培养的小问题

jilele

某不才，刚刚接手GS细胞（雄性小鼠）的培养，很多细节不甚明了，特发帖求助，望各位坛友不吝赐教，一起讨论。
" ?" _1 c( f! O; W0 y9 s* p6 d, {1）GS Medium 昂贵，但GS细胞增殖缓慢，克隆形态在六天内增长明显，但计数后发现其实细胞总数只增长了1/4，这个速度是否正常
7 Y; z6 a5 }/ Z4 ?  W2）文献特别指出GS细胞需要较低的饲养层密度（笔者用的是MEF，ICR品系），但实际操作上看GS细胞在低密度Feeder上增值缓慢，而且培养孔局部出现密集的圆形颗粒，具有折光性，疑为凋亡的GS细胞。GS细胞对饲养层密度以及状态要求是否严苛？
& e' c3 V$ _: p$ N+ r- ^2 F3）Feeder大批量用丝裂霉素C处理后能否冻存，备用，这个问题我查了很久，有支持也有反对的，反对意见主要来自师兄师姐，因为实践发现复苏后Feeder能损失一半，且状态不好，所以坚持随用随处理新MEF1 Y% z9 ~. N4 S7 b5 |0 r% G& c6 w
4）用0.05% Trypsine-EDTA处理共培养物1Min就发现Feeder连带克隆整体漂起，呈白膜状，吹打后仍有丝状体，无法吹散也离不下来，但内含大量细胞，因为Feeder在铺板前用Gelatine包被培养板，且培养液为无血清体系，怀疑饲养层状态差。3 A7 G$ \6 ^5 u9 q/ M: g
以上问题因初学SSC培养，所以不甚了解，欢迎大家指教

gemstone

1. 速度是正常的。! b' e) R7 @% L$ v) W
2. 如果圆形克隆在增值，应该不是调往细胞。可以通过半乳糖苷酶染色鉴定是否是凋亡细胞。
9 ]6 F; h% c8 g; p5 H  O3. 处理后的MEF可以冻存。最好是液氮冻存。计算好密度，解冻的时候会有部分细胞死亡。( c/ n9 i4 a) M
4. 理论上消化时间要长一点，刚刚漂起就中和消化，对于分散ssc并不是好事情。尝试3-5分钟后吹打，中和。

jilele

回复 gemstone 的帖子, e" P3 @; ?# H0 ?2 {
* `' Z6 u$ A* V$ H+ U& ]% o
感谢版主，受益匪浅
# ~2 d1 S8 l# }$ ]0 |0 j: Z关于第二条，我指的圆形折光颗粒比正常GS细胞还要小上一半，后续培养没有见它增殖或变大，而且与基底贴附略紧，PBS都洗不下来，索性就直接跟GS克隆一起冻存了
5 V# W  V* }7 ]0 ?0 j9 d3 j! r第三条，我解冻复苏的Feeder活细胞数目随冻存时间的延长越来越少了，起初160w细胞铺一个12-well板，现在240W都铺不满了，以后决定还是 现做现用
& D8 Z$ K2 K' K3 y( Y' Y第四条版主说的很对，因为GS克隆很好消化，1Min左右就分散开了，克隆就飘飘忽忽的，脱离了Feeder,但MEF还未彻底消化，如果此时中和，就会出现丝状卷曲物。我以前都是消化2min就中和了的。; j! {4 {, I7 s! q9 e* O3 w
. Y: t7 b' |2 s' T, k
不知版主有没有染过建系的GS细胞的CD90（Thy）抗体，我用的直标抗体（FITC），结果是阴性的，有点诧异··
4 E' e0 r3 M+ N6 U, D

sunny218

看了楼上的同仁们应该都是 很有经验的啊！！我才开始做SSC，现在想问问大家是用什么方法分离纯化的，还有用的是什么培养基呢？需要添加那些东西呢？跪求详细的步骤啊！！

gemstone

其实Thy1阳性细胞在刚开始的几代培养中是可以检测的。如果建系以后就很难检测到了。我有同感。! \, D( }4 j( g- E/ }
MEF每次都坐会比较麻烦，可以一次处理，冷冻以后使用，方便。
& D4 P# h3 f' m4 b- @- A4 Q/ a9 e9 r, }' f& u4 }
to sunny，有很多文章报道，最主要的是GDNF，bFGF，EGF， SCF等细胞因子。第一个非常重要。

细胞海洋

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