有关精原干细胞培养的小问题

jilele

某不才，刚刚接手GS细胞（雄性小鼠）的培养，很多细节不甚明了，特发帖求助，望各位坛友不吝赐教，一起讨论。0 ^; z2 p7 ?* \  ]  C# `  `2 p
1）GS Medium 昂贵，但GS细胞增殖缓慢，克隆形态在六天内增长明显，但计数后发现其实细胞总数只增长了1/4，这个速度是否正常
* l. ~0 N7 X! A' [- p2）文献特别指出GS细胞需要较低的饲养层密度（笔者用的是MEF，ICR品系），但实际操作上看GS细胞在低密度Feeder上增值缓慢，而且培养孔局部出现密集的圆形颗粒，具有折光性，疑为凋亡的GS细胞。GS细胞对饲养层密度以及状态要求是否严苛？
& l; V* ~4 B7 H% R$ _8 X3）Feeder大批量用丝裂霉素C处理后能否冻存，备用，这个问题我查了很久，有支持也有反对的，反对意见主要来自师兄师姐，因为实践发现复苏后Feeder能损失一半，且状态不好，所以坚持随用随处理新MEF) F$ n! N! u/ }" P9 b0 X
4）用0.05% Trypsine-EDTA处理共培养物1Min就发现Feeder连带克隆整体漂起，呈白膜状，吹打后仍有丝状体，无法吹散也离不下来，但内含大量细胞，因为Feeder在铺板前用Gelatine包被培养板，且培养液为无血清体系，怀疑饲养层状态差。- L0 g; `5 a# I- [7 a
以上问题因初学SSC培养，所以不甚了解，欢迎大家指教

gemstone

1. 速度是正常的。( Z# i% o! V: L2 [+ U
2. 如果圆形克隆在增值，应该不是调往细胞。可以通过半乳糖苷酶染色鉴定是否是凋亡细胞。" g6 _3 D/ W. \0 W9 E- T+ I
3. 处理后的MEF可以冻存。最好是液氮冻存。计算好密度，解冻的时候会有部分细胞死亡。
: R- r' [2 s6 s6 ]; C. A8 K  L4. 理论上消化时间要长一点，刚刚漂起就中和消化，对于分散ssc并不是好事情。尝试3-5分钟后吹打，中和。

jilele

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0 U7 j7 E1 o2 k: d4 U) b% L  W! [' A% P+ s6 r
感谢版主，受益匪浅" G1 `' K2 \" A( x# ?6 s
关于第二条，我指的圆形折光颗粒比正常GS细胞还要小上一半，后续培养没有见它增殖或变大，而且与基底贴附略紧，PBS都洗不下来，索性就直接跟GS克隆一起冻存了
; ^6 `, [4 d3 g8 k" u) H9 |% l第三条，我解冻复苏的Feeder活细胞数目随冻存时间的延长越来越少了，起初160w细胞铺一个12-well板，现在240W都铺不满了，以后决定还是 现做现用
; b& H' h; i2 I# Q9 G第四条版主说的很对，因为GS克隆很好消化，1Min左右就分散开了，克隆就飘飘忽忽的，脱离了Feeder,但MEF还未彻底消化，如果此时中和，就会出现丝状卷曲物。我以前都是消化2min就中和了的。
9 Q' x, ?3 |, G* q- i
3 K8 y4 S& b# n4 A) I! x3 U  ?" v7 m不知版主有没有染过建系的GS细胞的CD90（Thy）抗体，我用的直标抗体（FITC），结果是阴性的，有点诧异··
' b" b! G: t0 F/ ?& g0 K

sunny218

看了楼上的同仁们应该都是 很有经验的啊！！我才开始做SSC，现在想问问大家是用什么方法分离纯化的，还有用的是什么培养基呢？需要添加那些东西呢？跪求详细的步骤啊！！

gemstone

其实Thy1阳性细胞在刚开始的几代培养中是可以检测的。如果建系以后就很难检测到了。我有同感。/ t: M0 ?, z1 D0 U8 J. H
MEF每次都坐会比较麻烦，可以一次处理，冷冻以后使用，方便。1 n% C/ h+ {* z- S2 ~2 u

* o, {/ A4 s, R# g, V* o: y: k& e2 l& e. _to sunny，有很多文章报道，最主要的是GDNF，bFGF，EGF， SCF等细胞因子。第一个非常重要。

细胞海洋

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