关于CFU，成集落培养的问题

洛古16

请问，各位大神，+ D0 y3 F1 Y" d: i$ F
1、脐带间充质干细胞能进行甲基纤维素的成集落培养嘛？* _1 W$ q- U$ V* I# G+ Z
2、成品的甲基纤维素培养基100ml，一般分装多少ml一管呀？

洛古16

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洛古16

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) l1 F; D! m6 F6 M/ Z; i: T* ?- d5 k  }" |
吸量管会损失很多么？
. D0 X+ t1 i- a' a7 p对了，集落计数的时候，下面这种情况怎么按几个算呀？
6 E6 R9 x. P: ^1 ]/ c  [

jjjddf

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( H  k( b% f# H; g4 u8 j
我们用的是吸量管

洛古16

回复 jjjddf 的帖子- z" C: c4 E6 n2 z1 y5 l

+ E! Q1 m5 v3 h15ml啊，那用什么分装呀，注射器还是吸量管啊

洛古16

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5 f' N( Q! l, v+ {- I, n5 I* \' ]; Z# ^5 s& l
哈~~~非常感谢

子非鱼

我主要也是做的造血干细胞的集落。
* Z' R7 G1 N/ R我贴一下我在书上看到的集落重铺的内容，因为书上是讲自己配集落体系的情况，所以你斟酌着看吧。5 D8 C; |4 X/ z4 x
集落重铺
9 `8 |4 \& o! [  v    注意：该技术只适用于使用甲基纤维素培养的原代细胞。琼脂培养基过于坚硬，极其难将其中的集落挑出进行二次铺板培养。若要将CFU-GM的原代集落进行二次铺板培养，只需将琼脂替换为甲基纤维素，并将2×McCoys替换为IMDM。
" y. a) r5 e4 I9 @/ B材料/试剂  `" e) O4 R) q. l1 w; ^+ z
除非特别说明，所有材料均需灭菌* i- `" G. H& D6 Y9 k8 Q2 f. T
(1)        带通风设备的超净台
$ h2 [  z6 Z% l(2)        倒置显微镜" d& H1 p7 @6 ?0 u% O6 s
(3)        20ul微量移液器2 W# h( Z: L$ C. Y9 T
(4)        含青霉素/链霉素的IMDM
9 [' F$ X& h! R+ O3 \# f2 B(5)        12mm×75mm聚丙烯试管% t# A- S- R8 u% \4 J$ Q6 B5 Z- `
收集集落步骤
) J& c! M! l$ f& Y5 O所有步骤均需无菌操作。$ W$ t* u# J, ^
(1)        确定需要进行二次培养的集落数目。每个集落准备一只试管，加入100ul含有2%FBS的IMDM，拧紧盖子。. R% e$ j: p7 Q
(2)        将显微镜放置在有通风设备的超净台中。
2 ?8 y) c# V( W) V% @) s+ C/ Z(3)        将含有待收集集落的平板置于显微镜的载物台上，固定平皿并移去平皿盖。6 @9 b$ \0 q. a" l. B  r9 S
(4)        如果显微镜没有配置平皿固定装置，可将胶带的黏面向外环成一个圆圈，将两个这样的圆圈粘在载物台上，将平皿置于其上，同样能达到固定的目的。9 X9 ?# F# z, ^/ ~' o! M9 l
(5)        找到目的集落后，用20ul移液器轻轻吸出集落。
. D: D2 V, I9 c(6)        单独存在的集落最容易收集。+ ^4 o' x: H( ]
(7)        将集落转移到（准备好的）含100ulIMDM培养基的试管中，吹吸数次以清洗吸头。
) t* l% G( K! {/ s(8)        集落收集完毕后，进行铺板操作。" N7 p; S9 t; |
集落收集后的铺板步骤
2 G/ h  y# I9 M$ R* E- w+ }所有步骤均需无菌操作/ @7 Y, E& z8 e! ~/ n
(1)        计算收集到的集落数，按每个集落1.1ml的量准备培养基混合液（包括甲基纤维素），静置使气泡溢出。
# r$ l; H6 p" D& w1 Y( A$ t, E例如，如果你从含有IL-3、Epo和SCF等生长因子的平皿中收集了100个集落，那么就准备110ml培养液，所用生长因子与原始平皿中的相同，并在加入细胞之前加入甲基纤维素。
' C( b: T/ L5 A' m7 `(2)        当培养液澄清后，用配用16口径（gauge）针头的3～10ml注射器，向每个已含有收集到的集落的试管中加入1ml，振荡混匀。
: X1 s7 m: ?0 W(3)        静置。: t: x. I, \9 K% \( T7 \
(4)        将上述混合液倒入新的35mm平皿中，转动使液体覆盖平皿。
& W- g3 F( a( ?! o甲基纤维素比较黏稠，总会有培养液残留在试管中，因此不能100%重铺所有集落中的细胞。如果你的实验需要定量计算最后的结果，可以加入一定比例的培养基混合液，通过矫正计算进行统计。例如，加入1.1ml（1ml培养基+0.1ml收集的集落）培养基混合液中的0.9ml，所得的二代集落数则大致代表了全部集落中82%的集落生成细胞。
4 X( l" U& O9 R3 U, y# t(5)将平皿放在37℃、5%CO2/O2的湿润环境中培养14d.
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洛古16

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. z* h+ A6 Y3 Y6 h% p' x6 U6 k/ Q* X* I: C9 p2 A% H, r
有，STEMCELL的含有因子，木有EPO的培养基。
% e  T5 {/ z- l0 U0 x# H- |5 k那，原代集落的二次铺板是怎么操作法呀？. l! j& o2 w3 r$ Z
刚涉及成集落培养，看那个说明书好多都不认识。

jjjddf

我们分装一般是十五毫升，但是要看你的使用量来算

子非鱼

你现在是不是有一瓶甲基纤维素的培养基的体系啊？B cell的集落培养体系好像也是甲基纤维素的培养基，但是当时因为一些原因，我没有认真看产品的资料，所以也不确定。但是我们用的甲基纤维素的培养体系中有长出过间充质干细胞，但是不是聚集状的，所以间充质干细胞的集落应该是不行的。
, `8 x2 ?( f8 X  W3 D. `) l3 d你说的二倍培养，三倍培养是集落培养中的吗？我没有听过，只知道原代集落的二次铺板。7 I! u' }1 b9 R; j
我是个渣渣，所以很多了解的都不全面。