关于CFU，成集落培养的问题

洛古16

请问，各位大神，! w, ?) \$ R. N. m
1、脐带间充质干细胞能进行甲基纤维素的成集落培养嘛？
9 \& ^3 p$ T3 c* B0 b* r$ U! e& F2、成品的甲基纤维素培养基100ml，一般分装多少ml一管呀？

洛古16

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, R3 j9 f! z7 X$ ^# B0 j! i6 N
6 j( e# @$ p% J

洛古16

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$ f/ |, |( e( A) S; I' r0 y4 s( I3 I
' U; ~  s! M# ?  f/ I吸量管会损失很多么？
) s1 M: e/ ]; [0 u6 d% G对了，集落计数的时候，下面这种情况怎么按几个算呀？
1 s2 h/ f; g) d, t/ x

jjjddf

回复 洛古16 的帖子9 e8 b8 C% J1 Y, z0 T
' d3 }5 E4 `) D! C: E
我们用的是吸量管

洛古16

回复 jjjddf 的帖子) ~4 d4 a* S5 M1 Q# H; s5 q4 g

( k0 o* V! A4 E/ E2 c8 u) K4 \. m15ml啊，那用什么分装呀，注射器还是吸量管啊

洛古16

回复 子非鱼 的帖子7 u2 e; P4 O0 u* R+ A% V$ T
" J" O* ]/ J3 g; q2 ?: T- u& U
哈~~~非常感谢

子非鱼

我主要也是做的造血干细胞的集落。8 G+ B, Y: R% k
我贴一下我在书上看到的集落重铺的内容，因为书上是讲自己配集落体系的情况，所以你斟酌着看吧。# F9 U0 A0 U1 G6 B0 _3 N) e
集落重铺: K  N$ Z: P( M: }5 n/ ?
    注意：该技术只适用于使用甲基纤维素培养的原代细胞。琼脂培养基过于坚硬，极其难将其中的集落挑出进行二次铺板培养。若要将CFU-GM的原代集落进行二次铺板培养，只需将琼脂替换为甲基纤维素，并将2×McCoys替换为IMDM。4 {7 o! R# j! p! O
材料/试剂& D% L, U. H8 N  C1 v
除非特别说明，所有材料均需灭菌& P+ z$ r6 }  N0 P( b
(1)        带通风设备的超净台, D- H6 L7 U9 J1 o+ A! i% `5 z
(2)        倒置显微镜7 \) A+ U$ ]3 X9 s# R5 k- G( g8 f
(3)        20ul微量移液器8 @4 s& a+ O# v" Q
(4)        含青霉素/链霉素的IMDM, e+ c- t" v% @. H0 j7 f
(5)        12mm×75mm聚丙烯试管
% h; T9 r' [( @4 B$ h2 C收集集落步骤3 j6 Y8 e9 T1 L! o8 T& G
所有步骤均需无菌操作。
, M+ A3 [+ y* X' f0 y& x(1)        确定需要进行二次培养的集落数目。每个集落准备一只试管，加入100ul含有2%FBS的IMDM，拧紧盖子。6 z5 d6 Z6 ?1 M. `& ], g8 Z) C- u; X
(2)        将显微镜放置在有通风设备的超净台中。) ?7 m! a4 s; B, e5 F- J
(3)        将含有待收集集落的平板置于显微镜的载物台上，固定平皿并移去平皿盖。
# W, R" _- [3 J( w6 U& E5 H(4)        如果显微镜没有配置平皿固定装置，可将胶带的黏面向外环成一个圆圈，将两个这样的圆圈粘在载物台上，将平皿置于其上，同样能达到固定的目的。
1 A7 }% k# ~# `) ^9 f(5)        找到目的集落后，用20ul移液器轻轻吸出集落。; \/ c- g$ `" `% K' [, t- E6 }
(6)        单独存在的集落最容易收集。
+ m1 C1 k% S& B' r* D. I(7)        将集落转移到（准备好的）含100ulIMDM培养基的试管中，吹吸数次以清洗吸头。" k; f) _# @1 f
(8)        集落收集完毕后，进行铺板操作。- @. L8 Y/ Y. E! B7 T- ^9 y
集落收集后的铺板步骤
7 b. _8 e  ^* z所有步骤均需无菌操作
3 f$ N$ ?7 [/ N(1)        计算收集到的集落数，按每个集落1.1ml的量准备培养基混合液（包括甲基纤维素），静置使气泡溢出。4 ?3 M! m8 K) z8 f
例如，如果你从含有IL-3、Epo和SCF等生长因子的平皿中收集了100个集落，那么就准备110ml培养液，所用生长因子与原始平皿中的相同，并在加入细胞之前加入甲基纤维素。- o, t7 L, B* c; f0 g% g! {. D  o, r2 c2 n
(2)        当培养液澄清后，用配用16口径（gauge）针头的3～10ml注射器，向每个已含有收集到的集落的试管中加入1ml，振荡混匀。
( X# `/ K( R$ t) H6 Q7 q& I# r(3)        静置。
9 B) E2 G# c# _  g9 y! X' E# d' U(4)        将上述混合液倒入新的35mm平皿中，转动使液体覆盖平皿。
7 n% J* c) u: o0 Y& V# W1 u甲基纤维素比较黏稠，总会有培养液残留在试管中，因此不能100%重铺所有集落中的细胞。如果你的实验需要定量计算最后的结果，可以加入一定比例的培养基混合液，通过矫正计算进行统计。例如，加入1.1ml（1ml培养基+0.1ml收集的集落）培养基混合液中的0.9ml，所得的二代集落数则大致代表了全部集落中82%的集落生成细胞。
5 P5 s6 S# J- |0 |9 J, ^0 r(5)将平皿放在37℃、5%CO2/O2的湿润环境中培养14d.6 k+ A: T) W: M: Z( H

洛古16

回复 子非鱼 的帖子: F% w! Y) H! u

2 T2 C2 z# h# f  E有，STEMCELL的含有因子，木有EPO的培养基。
% G1 z$ K9 l5 p9 Q+ }6 q( b0 C1 Z  V那，原代集落的二次铺板是怎么操作法呀？
: |# f5 O( H4 r. P1 S刚涉及成集落培养，看那个说明书好多都不认识。

jjjddf

我们分装一般是十五毫升，但是要看你的使用量来算

子非鱼

你现在是不是有一瓶甲基纤维素的培养基的体系啊？B cell的集落培养体系好像也是甲基纤维素的培养基，但是当时因为一些原因，我没有认真看产品的资料，所以也不确定。但是我们用的甲基纤维素的培养体系中有长出过间充质干细胞，但是不是聚集状的，所以间充质干细胞的集落应该是不行的。- J* C+ ]7 J$ J3 F9 _
你说的二倍培养，三倍培养是集落培养中的吗？我没有听过，只知道原代集落的二次铺板。, t( s! D9 R! S
我是个渣渣，所以很多了解的都不全面。