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我主要也是做的造血干细胞的集落。; h" j9 z" D7 e; i* Y
我贴一下我在书上看到的集落重铺的内容，因为书上是讲自己配集落体系的情况，所以你斟酌着看吧。0 [6 b$ I$ q. K
集落重铺
4 M( p8 Q, ^/ [ 注意：该技术只适用于使用甲基纤维素培养的原代细胞。琼脂培养基过于坚硬，极其难将其中的集落挑出进行二次铺板培养。若要将CFU-GM的原代集落进行二次铺板培养，只需将琼脂替换为甲基纤维素，并将2×McCoys替换为IMDM。# Y( T' H, |/ C+ X K( [% @5 [
材料/试剂
0 K s+ z3 |6 q: {除非特别说明，所有材料均需灭菌
6 p0 k2 Y9 O N5 l1 k; U" M(1) 带通风设备的超净台
! v: R1 k" Y- R# @(2) 倒置显微镜
7 P' f0 e8 J/ g0 I: n5 D(3) 20ul微量移液器
* w- A) s. f3 c. {' R; f4 ]/ k(4) 含青霉素/链霉素的IMDM" p d. B) ^5 F2 @: T" f a
(5) 12mm×75mm聚丙烯试管
2 r* ?* R" g9 m6 j. D收集集落步骤
4 H1 l+ k7 O2 U$ _% C, j所有步骤均需无菌操作。5 L) y8 j: q( y! q8 U0 M
(1) 确定需要进行二次培养的集落数目。每个集落准备一只试管，加入100ul含有2%FBS的IMDM，拧紧盖子。$ V; t/ v. Y$ ?8 P7 A: M! q W. G
(2) 将显微镜放置在有通风设备的超净台中。
5 s% q; q1 D. k# g+ ?! {6 Y5 t(3) 将含有待收集集落的平板置于显微镜的载物台上，固定平皿并移去平皿盖。* r2 O% p/ N8 X# O: N0 u
(4) 如果显微镜没有配置平皿固定装置，可将胶带的黏面向外环成一个圆圈，将两个这样的圆圈粘在载物台上，将平皿置于其上，同样能达到固定的目的。
0 N6 u3 N7 t/ u; O(5) 找到目的集落后，用20ul移液器轻轻吸出集落。 ^, Z o( g4 t9 i
(6) 单独存在的集落最容易收集。/ N% i6 V: p4 O+ g! `+ x
(7) 将集落转移到（准备好的）含100ulIMDM培养基的试管中，吹吸数次以清洗吸头。- P; }1 w6 P9 E- M/ _) L+ M+ ~
(8) 集落收集完毕后，进行铺板操作。
1 X2 W& Q4 {) b集落收集后的铺板步骤
4 W1 T# l1 d: R0 S( u1 D所有步骤均需无菌操作% M" Q5 Z. N# K
(1) 计算收集到的集落数，按每个集落1.1ml的量准备培养基混合液（包括甲基纤维素），静置使气泡溢出。4 s a% t8 G* a. C# Q& Q4 Z* I- E
例如，如果你从含有IL-3、Epo和SCF等生长因子的平皿中收集了100个集落，那么就准备110ml培养液，所用生长因子与原始平皿中的相同，并在加入细胞之前加入甲基纤维素。2 M$ u0 \1 R6 s B! N) r
(2) 当培养液澄清后，用配用16口径（gauge）针头的3～10ml注射器，向每个已含有收集到的集落的试管中加入1ml，振荡混匀。
" C P1 q. C% e" c! ^$ C(3) 静置。
' T! d7 y6 ?/ b6 Q3 |! |8 t8 }: A! ^! B(4) 将上述混合液倒入新的35mm平皿中，转动使液体覆盖平皿。
% w2 n& z3 r, i" ~% k- Z# v甲基纤维素比较黏稠，总会有培养液残留在试管中，因此不能100%重铺所有集落中的细胞。如果你的实验需要定量计算最后的结果，可以加入一定比例的培养基混合液，通过矫正计算进行统计。例如，加入1.1ml（1ml培养基+0.1ml收集的集落）培养基混合液中的0.9ml，所得的二代集落数则大致代表了全部集落中82%的集落生成细胞。
. {- g( i& P, K- N8 T# ^(5)将平皿放在37℃、5%CO2/O2的湿润环境中培养14d.; t! S( M4 v. H8 d( U. T
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发表于 2014-7-21 13:57
