关于CFU，成集落培养的问题

洛古16

请问，各位大神，
9 n9 n$ H* I9 m4 q1、脐带间充质干细胞能进行甲基纤维素的成集落培养嘛？4 q' _* U% J, ^3 ^7 U9 I
2、成品的甲基纤维素培养基100ml，一般分装多少ml一管呀？

子非鱼

脐带间充质干细胞的集落应该是用液体培养基吧。成品的甲基纤维素培养基的分装的话，考虑种植时的损耗就分1ml一管，不考虑就可以分900ul一管。

洛古16

回复 子非鱼 的帖子2 l# g  C' d2 W( J. H% T+ A* {

0 a1 c. [: E$ D/ D* Z9 ?甲基纤维素的培养基只能用来检测造血干细胞，祖细胞的分化潜能么？
& @* W; _# j% g+ o培养当中的二倍培养，三倍培养是什么意思呢？9 H* D% W6 s. E5 f
还望不吝赐教啊，谢谢

子非鱼

你现在是不是有一瓶甲基纤维素的培养基的体系啊？B cell的集落培养体系好像也是甲基纤维素的培养基，但是当时因为一些原因，我没有认真看产品的资料，所以也不确定。但是我们用的甲基纤维素的培养体系中有长出过间充质干细胞，但是不是聚集状的，所以间充质干细胞的集落应该是不行的。
! ^. C6 j* }+ u9 D  R你说的二倍培养，三倍培养是集落培养中的吗？我没有听过，只知道原代集落的二次铺板。5 O0 D4 W' ^: }" m7 f" B; Z
我是个渣渣，所以很多了解的都不全面。

jjjddf

我们分装一般是十五毫升，但是要看你的使用量来算

洛古16

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+ e& m" D$ j& A
1 E+ _+ A: Y. _' C+ i: U* q有，STEMCELL的含有因子，木有EPO的培养基。5 O) r& g. ]/ x2 U0 ^
那，原代集落的二次铺板是怎么操作法呀？7 T- d1 {7 [7 ~
刚涉及成集落培养，看那个说明书好多都不认识。

子非鱼

我主要也是做的造血干细胞的集落。
+ p: {0 H5 H" t5 y/ T: ?我贴一下我在书上看到的集落重铺的内容，因为书上是讲自己配集落体系的情况，所以你斟酌着看吧。
; \% ]% }2 n' m6 a$ h集落重铺
+ w' j! v5 n# a* ?3 ^9 M- L) `    注意：该技术只适用于使用甲基纤维素培养的原代细胞。琼脂培养基过于坚硬，极其难将其中的集落挑出进行二次铺板培养。若要将CFU-GM的原代集落进行二次铺板培养，只需将琼脂替换为甲基纤维素，并将2×McCoys替换为IMDM。  \& M* ]; z( |; W& f1 P
材料/试剂
* t! d9 d3 R$ Q" f, D. S除非特别说明，所有材料均需灭菌
# R0 Q! M) `0 Q3 B1 W+ k. S1 P(1)        带通风设备的超净台
  T2 }2 e2 B- B( ?* h(2)        倒置显微镜  X9 J2 Y: w7 Y
(3)        20ul微量移液器* j8 `* e' n/ |+ ^0 f
(4)        含青霉素/链霉素的IMDM
1 ~9 f8 v2 S0 `! P3 v(5)        12mm×75mm聚丙烯试管: H9 A* N- [% f) F. ?' A& X
收集集落步骤. o6 W4 c- f, L! |9 v
所有步骤均需无菌操作。
% Q7 s* j6 ^' j5 i" M5 U(1)        确定需要进行二次培养的集落数目。每个集落准备一只试管，加入100ul含有2%FBS的IMDM，拧紧盖子。* u# {6 }' y! E; m: L! n9 u
(2)        将显微镜放置在有通风设备的超净台中。
) F" O' z4 p0 \* g: K! v' s(3)        将含有待收集集落的平板置于显微镜的载物台上，固定平皿并移去平皿盖。' q2 d9 \! H: Q% r5 Y  S: |
(4)        如果显微镜没有配置平皿固定装置，可将胶带的黏面向外环成一个圆圈，将两个这样的圆圈粘在载物台上，将平皿置于其上，同样能达到固定的目的。
+ q9 E3 Z) A/ l+ T) [; |: u(5)        找到目的集落后，用20ul移液器轻轻吸出集落。9 ]" z! Y3 X5 @- g
(6)        单独存在的集落最容易收集。
- s7 p1 ]& |: J7 u% N0 {(7)        将集落转移到（准备好的）含100ulIMDM培养基的试管中，吹吸数次以清洗吸头。  V# {' \: n  z0 k/ x& a
(8)        集落收集完毕后，进行铺板操作。
& a& q+ A: {2 D8 ?+ a1 {集落收集后的铺板步骤
$ U/ m& {9 y0 T  h6 U/ C所有步骤均需无菌操作
  L$ y$ @+ }6 ]8 P(1)        计算收集到的集落数，按每个集落1.1ml的量准备培养基混合液（包括甲基纤维素），静置使气泡溢出。
  r, T& f2 q- M: G8 G例如，如果你从含有IL-3、Epo和SCF等生长因子的平皿中收集了100个集落，那么就准备110ml培养液，所用生长因子与原始平皿中的相同，并在加入细胞之前加入甲基纤维素。  ^7 h' Y. k  ?3 A& t
(2)        当培养液澄清后，用配用16口径（gauge）针头的3～10ml注射器，向每个已含有收集到的集落的试管中加入1ml，振荡混匀。
; b) ?! d" ?- O4 q1 b(3)        静置。
0 W. _: c; F4 s4 N9 {0 p(4)        将上述混合液倒入新的35mm平皿中，转动使液体覆盖平皿。9 u* J( j/ z# Y
甲基纤维素比较黏稠，总会有培养液残留在试管中，因此不能100%重铺所有集落中的细胞。如果你的实验需要定量计算最后的结果，可以加入一定比例的培养基混合液，通过矫正计算进行统计。例如，加入1.1ml（1ml培养基+0.1ml收集的集落）培养基混合液中的0.9ml，所得的二代集落数则大致代表了全部集落中82%的集落生成细胞。& q- r' T5 K3 ?/ d% m
(5)将平皿放在37℃、5%CO2/O2的湿润环境中培养14d./ G! K+ A! Y3 g$ e2 A

洛古16

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& o* d: c) S' M% M! y$ {( [- w8 ~7 r# @) k7 F
哈~~~非常感谢

洛古16

回复 jjjddf 的帖子4 V3 }5 `6 |6 x7 S1 R+ S& x3 V6 N
$ Y- A% [. M/ p- G9 B
15ml啊，那用什么分装呀，注射器还是吸量管啊

jjjddf

回复 洛古16 的帖子* {* J6 {9 k5 q9 J6 K) l: _

) J7 s/ p+ y2 r7 T我们用的是吸量管