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我主要也是做的造血干细胞的集落。
* j; L- u. |# j7 m$ M( E我贴一下我在书上看到的集落重铺的内容，因为书上是讲自己配集落体系的情况，所以你斟酌着看吧。
. r/ g2 o/ Z$ G& b" \0 N" t4 b" M9 K集落重铺
( U3 Q, ~/ D9 @+ M 注意：该技术只适用于使用甲基纤维素培养的原代细胞。琼脂培养基过于坚硬，极其难将其中的集落挑出进行二次铺板培养。若要将CFU-GM的原代集落进行二次铺板培养，只需将琼脂替换为甲基纤维素，并将2×McCoys替换为IMDM。
( L" ?& ]) I& O, P# W; E材料/试剂) o# i# a/ `$ g! @
除非特别说明，所有材料均需灭菌
( V4 l/ `/ @" B. ?(1) 带通风设备的超净台# Y8 o7 a6 W1 O) n" F" K2 ]& @( b
(2) 倒置显微镜4 f$ |, Z* a- c0 h& X9 D
(3) 20ul微量移液器
( j0 g" O |6 ^ w# L8 L: D. W L(4) 含青霉素/链霉素的IMDM- V3 h) l7 `' j7 T$ A
(5) 12mm×75mm聚丙烯试管* w+ O' P* U/ Q1 y1 w) H! F |; }
收集集落步骤
7 _% U) u( v+ z( H所有步骤均需无菌操作。
; I: b& w4 D2 p; Z ^# `$ w(1) 确定需要进行二次培养的集落数目。每个集落准备一只试管，加入100ul含有2%FBS的IMDM，拧紧盖子。0 r, `3 |( X. }- b
(2) 将显微镜放置在有通风设备的超净台中。
8 `0 s8 q4 {, n(3) 将含有待收集集落的平板置于显微镜的载物台上，固定平皿并移去平皿盖。7 M. H( b. W% [! h
(4) 如果显微镜没有配置平皿固定装置，可将胶带的黏面向外环成一个圆圈，将两个这样的圆圈粘在载物台上，将平皿置于其上，同样能达到固定的目的。3 i4 L4 Y/ X) `# [6 O
(5) 找到目的集落后，用20ul移液器轻轻吸出集落。3 e: L/ @$ D7 S' C
(6) 单独存在的集落最容易收集。/ c+ ^8 y0 L4 p4 @) d
(7) 将集落转移到（准备好的）含100ulIMDM培养基的试管中，吹吸数次以清洗吸头。
3 y. v; f# ]! n' | o(8) 集落收集完毕后，进行铺板操作。
' a" p6 [& R9 F; _9 v集落收集后的铺板步骤$ {! a6 {2 U, D- D S/ u9 _
所有步骤均需无菌操作
5 V! G+ t P2 ~4 ~/ }. _4 \' s(1) 计算收集到的集落数，按每个集落1.1ml的量准备培养基混合液（包括甲基纤维素），静置使气泡溢出。: @9 L' E: m( X0 Q* M" ~" h
例如，如果你从含有IL-3、Epo和SCF等生长因子的平皿中收集了100个集落，那么就准备110ml培养液，所用生长因子与原始平皿中的相同，并在加入细胞之前加入甲基纤维素。
$ y# E% f4 F7 p6 }. \(2) 当培养液澄清后，用配用16口径（gauge）针头的3～10ml注射器，向每个已含有收集到的集落的试管中加入1ml，振荡混匀。, I! u# k, w$ Y! H
(3) 静置。
$ p3 g. N [. @9 ~" d(4) 将上述混合液倒入新的35mm平皿中，转动使液体覆盖平皿。
x2 S/ u4 y- F8 \. e d5 ^甲基纤维素比较黏稠，总会有培养液残留在试管中，因此不能100%重铺所有集落中的细胞。如果你的实验需要定量计算最后的结果，可以加入一定比例的培养基混合液，通过矫正计算进行统计。例如，加入1.1ml（1ml培养基+0.1ml收集的集落）培养基混合液中的0.9ml，所得的二代集落数则大致代表了全部集落中82%的集落生成细胞。
% X) c, d6 U1 r. `(5)将平皿放在37℃、5%CO2/O2的湿润环境中培养14d." `+ p1 d# S: ~
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发表于 2014-7-21 13:57
