关于CFU，成集落培养的问题

洛古16

请问，各位大神，' q% u( Z. Q* z* F7 E
1、脐带间充质干细胞能进行甲基纤维素的成集落培养嘛？
9 ]- H. f) T3 G, m+ U7 ]5 c2、成品的甲基纤维素培养基100ml，一般分装多少ml一管呀？

子非鱼

脐带间充质干细胞的集落应该是用液体培养基吧。成品的甲基纤维素培养基的分装的话，考虑种植时的损耗就分1ml一管，不考虑就可以分900ul一管。

洛古16

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5 g. m" ^5 |1 L/ Q* B6 y2 @7 I2 a3 w5 A
甲基纤维素的培养基只能用来检测造血干细胞，祖细胞的分化潜能么？
7 Q, @# y* W; S" [" h! e4 v培养当中的二倍培养，三倍培养是什么意思呢？
: p) R5 \( V3 p' `- t# W3 {还望不吝赐教啊，谢谢

子非鱼

你现在是不是有一瓶甲基纤维素的培养基的体系啊？B cell的集落培养体系好像也是甲基纤维素的培养基，但是当时因为一些原因，我没有认真看产品的资料，所以也不确定。但是我们用的甲基纤维素的培养体系中有长出过间充质干细胞，但是不是聚集状的，所以间充质干细胞的集落应该是不行的。1 S8 V$ T+ [% I6 l& Z. Q/ I
你说的二倍培养，三倍培养是集落培养中的吗？我没有听过，只知道原代集落的二次铺板。
, i' b- Q1 s5 G: I* m6 Q) d我是个渣渣，所以很多了解的都不全面。

jjjddf

我们分装一般是十五毫升，但是要看你的使用量来算

洛古16

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. s! s+ b9 X; ^1 S
. e+ R* Z: O$ j6 Q有，STEMCELL的含有因子，木有EPO的培养基。! X4 I9 k+ |# @7 j
那，原代集落的二次铺板是怎么操作法呀？% V, m: p/ s! C" h* \) h: }7 @
刚涉及成集落培养，看那个说明书好多都不认识。

子非鱼

我主要也是做的造血干细胞的集落。$ X3 l* r% t0 [  W
我贴一下我在书上看到的集落重铺的内容，因为书上是讲自己配集落体系的情况，所以你斟酌着看吧。* e$ n1 ]  G& ]# ~0 I5 k! P
集落重铺4 |/ x$ i( p& W9 U- W- O' O
    注意：该技术只适用于使用甲基纤维素培养的原代细胞。琼脂培养基过于坚硬，极其难将其中的集落挑出进行二次铺板培养。若要将CFU-GM的原代集落进行二次铺板培养，只需将琼脂替换为甲基纤维素，并将2×McCoys替换为IMDM。
/ O7 c, U5 r2 Q4 _( S5 L4 z  _材料/试剂
+ b- ]$ U' s# s3 d. q) m除非特别说明，所有材料均需灭菌& j, a, y4 b" \3 X) i
(1)        带通风设备的超净台
- T2 }$ m+ f: J! N, J6 j! Q(2)        倒置显微镜
; G+ [9 E, P" L* T9 x2 K3 r(3)        20ul微量移液器5 R/ K6 c: \( j8 t  A8 _& [" v- `
(4)        含青霉素/链霉素的IMDM7 _. R( S% @2 F' d8 Z8 Y( |
(5)        12mm×75mm聚丙烯试管
* N  p& |3 Z/ K) U; u# h! f  n收集集落步骤
( w: k4 B1 M. _/ j所有步骤均需无菌操作。
. z/ b7 i# ?9 f  ]! t; ~, T(1)        确定需要进行二次培养的集落数目。每个集落准备一只试管，加入100ul含有2%FBS的IMDM，拧紧盖子。9 m; ]% O/ a: J) ?. G) i
(2)        将显微镜放置在有通风设备的超净台中。2 Z! F5 I& `5 t5 `
(3)        将含有待收集集落的平板置于显微镜的载物台上，固定平皿并移去平皿盖。
! n' Y; _; R* D4 l6 J(4)        如果显微镜没有配置平皿固定装置，可将胶带的黏面向外环成一个圆圈，将两个这样的圆圈粘在载物台上，将平皿置于其上，同样能达到固定的目的。
% `* [( M* }' n; Y' S% S* Q  `(5)        找到目的集落后，用20ul移液器轻轻吸出集落。
' w+ Y" k6 `6 v9 l  z* ]! O(6)        单独存在的集落最容易收集。& @0 B0 \: M' L8 @) |# A
(7)        将集落转移到（准备好的）含100ulIMDM培养基的试管中，吹吸数次以清洗吸头。- J" Y! E& a9 O
(8)        集落收集完毕后，进行铺板操作。, D+ r! M) S& ~+ s9 Q4 M
集落收集后的铺板步骤
# Q; w9 K  u/ R  w% k5 t( u所有步骤均需无菌操作
5 u$ R% o& N/ d8 h( m2 L(1)        计算收集到的集落数，按每个集落1.1ml的量准备培养基混合液（包括甲基纤维素），静置使气泡溢出。3 Z, e0 U" p+ c6 ^8 h
例如，如果你从含有IL-3、Epo和SCF等生长因子的平皿中收集了100个集落，那么就准备110ml培养液，所用生长因子与原始平皿中的相同，并在加入细胞之前加入甲基纤维素。
& G* w9 }) ~7 ]' w& _(2)        当培养液澄清后，用配用16口径（gauge）针头的3～10ml注射器，向每个已含有收集到的集落的试管中加入1ml，振荡混匀。' D8 ]" O& g# G" W. J: R
(3)        静置。
0 E& Q: H9 i1 V  R' B  v  z2 c(4)        将上述混合液倒入新的35mm平皿中，转动使液体覆盖平皿。
# b4 m+ g- K( R  W# T: K' v甲基纤维素比较黏稠，总会有培养液残留在试管中，因此不能100%重铺所有集落中的细胞。如果你的实验需要定量计算最后的结果，可以加入一定比例的培养基混合液，通过矫正计算进行统计。例如，加入1.1ml（1ml培养基+0.1ml收集的集落）培养基混合液中的0.9ml，所得的二代集落数则大致代表了全部集落中82%的集落生成细胞。
7 p( ~1 D# x4 H) d* H(5)将平皿放在37℃、5%CO2/O2的湿润环境中培养14d.5 H- ]$ _4 }" [( v

洛古16

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5 v' P1 Q6 m4 ?; b
, @# t) v6 N6 ]1 I; J8 b8 j哈~~~非常感谢

洛古16

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6 `' f, R2 w0 S. b; P' D  B; N8 ~/ N3 d. G# T/ i
15ml啊，那用什么分装呀，注射器还是吸量管啊

jjjddf

回复 洛古16 的帖子' U) O# g+ ~8 m6 c) {

$ p4 f0 w: d; I; }我们用的是吸量管